苏云金芽孢杆菌晶体杀虫蛋白Cry1Ac基因在虫生真菌球孢白僵菌中的表达

论文摘要

真菌杀虫剂具有效费比高、安全性好、能够发挥持续控制效果并且易于人工培养等优点,但存在受环境影响较大、杀虫效果慢和效果不稳定等弱点,因而一定程度上限制了其大规模应用。为此人们一直在潜心研究虫生真菌的致病分子机制，以寻找可通过基因工程手段进行改造的基因。苏云金芽孢杆菌为革兰氏阳性菌，在菌体的稳定生长期可形成伴胞晶体蛋白（parasporal crystal protein）,又称杀虫晶体蛋白（insecticidal crystal protein, ICP）或δ-内毒素，是一类对害虫毒力强、致死速度快且对害虫天敌无毒性的昆虫病原微生物，昆虫病原细菌苏云金芽孢杆菌晶体杀虫蛋白Cry1Ac基因表达的杀虫效果非常好，但能否增强真菌的毒力尚不清楚。本研究将外源的苏云金芽孢杆菌的毒力基因Cry1Ac分别转入重要虫生真菌球孢白僵菌的两个野生型菌株：马尾松毛虫分离株RCEF0013，以及玉米螟分离株RCEF3383，以构建两个单拷贝的Cry1Ac超表达转基因工程菌株。本实验首先构建了含有筛选标记bar基因和外源基因Cry1Ac的载体pbarGPE1-Cry1Ac，通过芽生孢子法将载体质粒转入该野生型出发株RCEF0013和RCEF3383，在加入草胺磷（100g/ml）的SDAY培养基上筛选获得转化子，获得了一价转Cry1Ac基因的工程菌株RCEF0013-G1和RCEF3383-G1,从而使该Cry1Ac基因在转化的菌株中得到超表达。对马尾松毛虫（Dendrolimus punctatus）进行生物测定的结果显示，工程株Bb13-G1对马尾松毛虫的LC25比出发株降低5.4倍，LD25减少7.1倍，LT25缩短2.2d，说明其对马尾松毛虫的侵染毒力明显提高；喂食处理和虫体喷雾喂食结合处理与单纯虫体喷雾处理相比，累计致死率分别提高了55.6%和63.0%，致死中时分别缩短了4.5d和5.3d。实验结果表明苏云金芽孢杆菌晶体杀虫蛋白Cry1Ac基因在白僵菌Bb13中成功表达其胃毒作用效果明显，提高了球孢白僵菌的毒力。这是Cry1Ac基因首次在虫生真菌中表达。对玉米螟（Ostrinia furnacalis）进行生物测定的结果表明，工程株Bb1944-G1喷雾处理组的LC50和LD50比出发菌株Bb1944分别降低5倍和7.2倍；在2×108孢子/ml浓度下工程株喷雾组的LT50比出发株缩短1.7d，说明其对玉米螟的侵染毒力明显提高。两个菌株的毒力测定都说明Cry1Ac基因在转入白僵菌后得到了表达，使得工程菌对松毛虫和玉米螟的毒力明显增强。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 文献综述
• 1.1 生物防治技术的历史
• 1.2 虫生真菌的应用前景
• 1.3 虫生真菌基因工程的研究进展
• 1.4 虫生真菌的致病机理
• 1.4.1 体表附着阶段
• 1.4.2 体壁穿透阶段
• 1.4.3 体内定殖阶段
• 1.5 几种与毒力有关的活性物质的研究现状
• 1.5.1 Bt 毒力蛋白
• 1.5.2 几丁质酶
• 1.5.3 蝎毒
• 1.6 几种虫生真菌的遗传转化方法
• 1.6.1 电击转化法
• 1.6.2 PEG/原生质体转化法
• 1.6.3 芽生孢子转化方法
• 1.6.4 农杆菌介导转化法
• 1.6.5 基因枪转化法
• 1.7 总结与展望
• 2 引言
• 3 材料与方法
• 3.1 材料
• 3.1.1 供试菌株
• 3.1.2 供试质粒与基因
• 3.1.3 药品与试剂
• 3.1.4 培养基
• 3.1.5 主要的仪器设备
• 3.2 方法
• 3.2.1 技术流程
• 3.2.2 pbarGPE1-pGEX/Cry1AC 中间载体的构建流程图
• 3.2.3 pbarGPE1-pGEX/Cry1AC 转化虫生真菌试验流程图
• 3.2.4 试验方法及步骤
• 3.2.5 芽生孢子转化法
• 3.2.6 球孢白僵菌基因组 DNA 的提取
• 3.2.7 真菌转化子的 PCR 初步筛选与验证
• 3.2.8 毒力的生物测定
• 3.2.9 验证目的基因在菌株内的稳定性
• 4 结果与分析
• 4.1 目的基因片段 pGEX/Cry1AC 的扩增结果
• 4.2 pbarGPE1 和 pGEX/Cry1AC 酶切结果
• 4.3 pbarGPE1-pGEX/Cry1AC 重组质粒的菌落 PCR 验证结果
• 4.4 pbarGPE1-pGEX/Cry1AC 重组质粒的酶切验证
• 4.5 球孢白僵菌转化子的测序验证
• 4.6 芽生孢子形态
• 4.7 Bb13-G1 工程菌株毒力的生物测定
• 4.8 Bb1944-G1 工程菌株毒力的生物测定
• 4.9 目的基因在菌株内的遗传稳定性验证
• 5 讨论
• 6 小结
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介