基于水稻全长cDNA的大豆种质创新技术体系的构建

论文摘要

种质创新是作物种质资源有效利用的前提和关键，是顺利开展作物遗传育种工作的基础和保证。50多年来，我国作物种质创新在促进农业新品种更新换代、提高粮食产量、保障我国的粮食安全等方面做出了巨大贡献。大豆是人类食用油和蛋白质的主要来源，而普通栽培大豆遗传基础过于狭窄、传统种质创新周期过于漫长，难以满足大豆育种的需求。此外，国外对基因的专利保护更是影响了我国大豆转基因育种的进程。因此，改善现有的大豆种质创新技术，不断提高大豆种质创新效率，将是缓解作物种质资源相对贫乏与育种需求不断增大之间矛盾所需解决的首要问题。本研究借助转基因技术的原理和方法，在获得了高质量水稻全长cDNA的前提下，开展了高通量转化表达载体的构建以及农杆菌介导大豆转化体系的优化等方面的研究，并最终构建了基于水稻全长cDNA的大豆种质创新技术体系。对转基因大豆植株的组织化学检测及分子生物学的检测结果证明了该种质创新技术体系的可行性。大豆种质创新技术体系的建立为农作物种质创新突破国外基因专利保护，充分发挥植物转基因技术在种质创新中的应用潜力以及实现优异农艺性状的跨种、属间的基因交流提供了全新的思路。本研究取得的主要研究结果如下所述：1．高质量水稻全长cDNA的获得。本研究以抗逆性水稻品种靖粳7号、合系15号、珍珠42、辽盐16、早稻277、及早稻502为材料，得到了不同时间点混合的水稻抗旱、耐盐、耐冷胁迫处理下的总RNA，利用SMART技术合成水稻全长cDNA，利用pGEM-T easy载体试剂盒克隆所得水稻cDNA，单克隆菌液PCR扩增结果表明所得水稻ds cDNA片段平均长度为900bp，插入片段大小分布在0.3～2kb。2．携带不同大小水稻cDNA高效表达载体的构建。经过片段分级的水稻cDNA采用平末端连接和T-A连接两种方案分别与具有相应末端的双元表达载体质粒DNA连接并转化农杆菌，制备含有连接着水稻不同大小cDNA表达载体的工程菌液，用于农杆菌介导的大豆遗传转化。对平末端连接和T-A连接两种连接效果的鉴定结果显示得到了连接有外源水稻cDNA的质粒表达载体，连接效率为60％～75％，连接效率较低，有待改进。3．农杆菌介导的大豆高效遗传转化体系的建立。选用了3个大豆栽培品种中品661、垦农18和绿75，在已有研究基础上，本文首次探索了介于子叶节和胚尖之间的新的外植体类型，即带有1片子叶的胚尖，该方法大大缩短了试验流程，而且此转化技术体系的再生率达90％以上（中品661为95％；垦农18为93％；绿75为90％），高于子叶节的50％和胚尖的70％；分子检测结果表明转化效率高达10％（垦农18）。因此，本研究建立的大豆农杆菌介导的转化技术体系较前人的更加快速、高效，将是从事农杆菌介导的大豆转基因、突变体构建等基因组学研究强有力的技术平台。4．新型大豆种质创新体系的验证。将连接有水稻不同全长cDNA的载体转化农杆菌后，借助于本研究初步建立的农杆菌介导的大豆新型外植体遗传转化技术体系，获得了500多株大豆转基因再生植株。经过对大豆再生植株的组织化学GUS检测、PCR及Southern杂交等分子生物学检测，结果表明水稻cDNA已经转移到了大豆基因组中，证明了本研究所探索的基于水稻全长cDNA的大豆种质创新技术体系是可行的。5．与传统的种质创新技术相比，本研究构建的基于水稻全长cDNA的大豆种质创新技术体系具有如下的优点：（1）外源基因不受基因专利的限制：本技术体系所需的外源基因直接来自水稻全长cDNA，不必知道所转基因的序列，突破了国外基因专利的壁垒；（2）最大限度地突破物种间的生殖隔离：利用转基因技术的原理和方法使得种质创新不仅可以在不同科、族间，甚至可以打破动植物间的界限而进行，拓宽了优异基因应用领域；（3）提高了种质创新的效率：以往的植物转基因过程中，一次转基因事件只能完成1～2个基因的转移，该技术体系是直接转移所得水稻全长cDNA“基因池”，实现了植物转基因的高通量转化；同时，该技术体系省略了费时、费力的基因克隆步骤。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1.1 作物种质资源研究概况
• 1.2 作物种质资源创新研究
• 1.2.1 作物种质资源创新的必要性
• 1.2.2 传统作物种质资源创新的途径
• 1.2.3 基于转基因技术的作物种质资源创新
• 1.3 我国大豆种质资源与遗传改良研究现状
• 1.3.1 我国大豆种质资源研究现状
• 1.3.2 我国大豆遗传改良研究
• 1.4 研究目的与意义
• 1.5 研究的技术路线
• 第二章 材料与方法
• 2.1 植物材料
• 2.1.1 大豆材料
• 2.1.2 水稻材料
• 2.2 主要化学试剂、酶类及试剂盒
• 2.3 培养基、溶液等试剂的配制
• 2.3.1 大豆遗传转化主要组织培养基配方
• 2.3.2 其它试剂及培养基配方
• 2.4 主要实验技术
• 2.4.1 水稻材料胁迫处理
• 2.4.2 植物叶片总 RNA的分离与检测
• 2.4.3 mRNA的分离
• 2.4.4 工程菌液制备
• 2.4.5 基因组DNA的提取
• 2.4.6 PCR反应
• 2.4.7 Southern杂交
• 第三章 连接有水稻不同cDNA表达载体的构建
• 3.1 高质量水稻全长cDNA的获得及其末端的改造
• 3.1.1 总RNA的提取与检测
• 3.1.2 mRNA的分离
• 3.1.3 高质量水稻全长cDNA的合成与质量检测
• 3.1.4 水稻ds cDNA片段大小检测
• 3.1.5 水稻cDNA测序分析
• 3.1.6 水稻ds cDNA末端的补平
• 3.2 载体的筛选与改造
• 3.2.1 质粒载体筛选的原则
• 3.2.2 载体的改造
• 3.3 含不同大小水稻基因表达载体的工程菌构建
• 3.3.1 含不同大小水稻基因表达载体的构建
• 3.3.2 连接产物转化农杆菌
• 3.3.3 农杆菌单克隆菌液PCR检测平末端连接效果
• 3.3.4 含不同大小水稻基因表达载体的工程菌液制备
• 3.4 结果与分析
• 3.4.1 水稻总RNA及mRNA浓度与质量检测结果
• 3.4.2 水稻cDNA的获得
• 3.4.3 插入水稻cDNA片段长度的鉴定
• 3.4.4 部分水稻cDNA序列分析
• 3.4.5 双元表达载体的酶切鉴定
• 3.4.6 平末端连接效果的检测结果
• 3.4.7 T-A连接效果的检测结果
• 3.5 小结
• 第四章 农杆菌介导大豆快速高效转化体系的构建
• 4.1 传统农杆菌介导大豆转化体系的优化
• 4.1.1 工程菌液制备
• 4.1.2 大豆种子表面消毒
• 4.1.3 大豆种子萌发及不同外植体的获得
• 4.1.4 农杆菌侵染大豆外植体
• 4.1.5 农杆菌与大豆外植体共培养
• 4.1.6 大豆外植体的丛生芽诱导
• 4.1.7 大豆外植体的芽伸长诱导
• 4.1.8 大豆外植体的生根诱导
• 4.1.9 大豆外植体的移栽
• 4.1.10 发芽培养基中6-苄氨基嘌呤的优化
• 4.1.11 诱导培养基中激素浓度的优化
• 4.1.12 其它因子的优化
• 4.2 快速、高效农杆菌介导大豆转化体系的构建
• 4.2.1 工程菌液制备
• 4.2.2 大豆种子表面消毒
• 4.2.3 大豆种子萌发及外植体的获得
• 4.2.4 农杆菌侵染大豆外植体
• 4.2.5 农杆菌与大豆外植体共培养
• 4.2.6 大豆外植体的移栽
• 4.2.7 大豆不同基因型的比较
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 农杆菌介导大豆子叶节和胚尖转化系统的优化
• 4.3.2 快速、高效农杆菌介导大豆转化体系的建立
• 第五章 携带水稻CDNA大豆转基因植株的检测
• 5.1 携带水稻cDNA大豆转基因植株的获得
• 5.2 大豆转基因株系的表型鉴定
• 5.3 大豆转基因株系组织化学GUS基因表达鉴定
• 5.4 大豆转基因株系的分子鉴定
• 5.4.1 转基因植株的PCR检测
• 5.4.2 RT-PCR检测
• 5.4.3 Southern检测
• 5.5 结果与分析
• 5.5.1 大豆转化再生植株的表型鉴定
• 5.5.2 大豆转化再生植株的组织化学和分子鉴定
• 第六章 讨论
• 6.1 基于水稻全长cDNA的大豆种质创新技术体系的建立
• 6.1.1 高质量水稻全长cDNA的获得
• 6.1.2 载体的筛选和改造
• 6.1.3 快速、高效农杆菌介导大豆转基因技术体系的建立
• 6.2 基于水稻全长cDNA的大豆种质创新技术体系的验证
• 6.3 本研究大豆种质创新技术体系存在的问题
• 6.3.1 cDNA序列的完整性
• 6.3.2 cDNA片段分级准确性
• 6.3.3 cDNA“基因池”的容量
• 6.4 今后研究计划
• 6.4.1 技术体系的完善
• 6.4.2 技术体系的应用
• 第七章 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 作者简介