白细胞介素-2和粒细胞—巨噬细胞集落刺激因子的克隆与表达

论文摘要

鸡柔嫩艾美耳球虫属于具有顶复合器的原生动物,主要寄生于鸡的盲肠中,常常引起大批鸡只的死亡,如何更好的控制球虫病是兽医工作者面临的一个课题,本文对细胞因子IL-2和GM-CSF展开研究。根据GenBank上发表的鸡的IL-2和GM-CSF序列,设计引物。逆转录多聚酶链式反应（RT-PCR）方法,从人工感染柔嫩艾美耳球虫的雏鸡盲肠扁桃体中扩增到了391bp和435bp的DNA片段,将两片段与pGEM-T载体连接后转化JM109感受态细胞,经蓝白斑筛选、PCR鉴定后,将阳性质粒进行测序。结果表明,扩增片断为鸡IL-2和GM-CSF。IL-2和GM-CSF基因与GenBank中报道的序列仅有1-2个碱基的差异,IL-2与鹌鹑的同源性为54.5%,而与哺乳动物IL-2的同源性在29.9%34.5%之间。GM-CSF与哺乳动物的同源性在35.2%45.4%之间。以鸡β-Actin为内参进行半定量RT-PCR检测柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊免疫前后鸡盲肠扁桃体IL-2和GM-CSF基因表达的动态变化。结果表明,ChIL-2在第一次免疫后的第九天和第二次免疫后的第七天ChIL-2的表达明显升高;ChGM-CSF在第一次免疫后的第一天（P<0.05）和第二次免疫后的第七天（P<0.01）,ChGM-CSF的表达量显著升高,在第一次免疫后的第九天和第二次免疫后的第三天ChGM-CSF的表达量显著降低（P<0.01）。按照pGEX-6p-1表达载体的多克隆位点,重新设计IL-2和GM-CSF带有相应限制性内切酶酶切位点的引物,通过RT-PCR克隆获得两目的基因,与pGEM-T载体连接后转化JM109感受态细胞,经蓝白斑筛选、测序正确后,进行双酶切,胶回收酶切后的目的基因片段,将其与pGEX-6p-1表达载体连接,转化入BL21感受态细胞中。经双酶切和PCR鉴定为阳性的菌株,测序鉴定正确后,用IPTG最佳诱导条件表达IL-2和GM-CSF蛋白。通过菌体裂解,包涵体的洗涤、溶解、复性后,过Sepharose 4B柱纯化GST融合蛋白。Western Blot检测IL-2和GM-CSF融合蛋白,通过淋巴细胞增殖试验证明纯化的IL-2和GM-CSF融合蛋白具有一定的生物学活性。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1 引言
• 2 白细胞介素-2 的研究进展
• 3 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的研究进展
• 4 展望
• 第二章 海兰灰蛋鸡盲肠扁桃体中白细胞介素-2 与粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的克隆与序列分析
• 1 引言
• 2 材料
• 3 方法
• 4 结果
• 5 讨论
• 第三章 柔嫩艾美耳球虫免疫与鸡盲肠扁桃体中IL-2 和GM-CSF 基因的表达动态
• 1 引言
• 2 材料
• 3 方法
• 4 结果
• 5 讨论
• 第四章 白介素-2 与粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子基因的原核表达与生物学活性检测
• 1 引言
• 2 材料
• 3 方法
• 4 结果
• 5 讨论
• 结论
• 创新点
• 参考文献
• 致谢
• 附录
• 作者简介