膜荚黄芪cDNA文库构建与异黄酮合成酶基因的克隆

膜荚黄芪cDNA文库构建与异黄酮合成酶基因的克隆

论文摘要

膜荚黄芪为长白山区濒危的野生药用植物之一,是珍贵的中药材资源,其次生代谢产物具有多种生理功能,具有重要的药用价值。但是膜荚黄芪功能基因和次生代谢生物合成途径的研究相对较少。因此,保存膜荚黄芪基因资源和加速基因水平的研究进程具有重要意义。本文构建了野生膜荚黄芪根的cDNA文库,通过cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends,RACE)方法克隆了异黄酮合成酶(IFS)基因的全长序列,分析了IFS基因在膜荚黄芪叶片和不定根中的表达情况,并第一次尝试将IFS基因转入生菜。应用SMART技术成功构建了膜荚黄芪根cDNA文库。经文库质量鉴定表明:原始文库滴度为4.6×105 cfu/mL,重组率接近100%,插入片段大小范围在0.5-2kb之间。利用RACE技术从膜荚黄芪中克隆了异黄酮合成中起关键作用的IFS基因全长cDNA序列,命名为AmIFS(登录号:JN882009)。AmIFS cDNA全长1903 bp,包括1578 bp的ORF,116 bp的5’非转译区(5’UTR),209 bp的3’非转译区(3’UTR)和13 bp的polyA尾,推测其编码525个氨基酸。通过半定量实验表明,在膜荚黄芪生长发育过程的5个时期中,IFS基因在花期(6月)表达量最低,在10月份表达量最高;IFS基因在不定根生长过程中持续表达,预示不定根能够生物合成黄芪异黄酮。转IFS基因生菜实验,初步确定了外源的膜荚黄芪IFS基因已经整合进生菜基因组。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 前言
  • 1 材料与方法
  • 1.1 实验材料
  • 1.1.1 试验试剂
  • 1.1.2 培养基与缓冲液
  • 1.2 cDNA文库构建
  • 1.2.1 膜荚黄芪总RNA的提取
  • 1.2.2 cDNA第一链合成
  • 1.2.3 Primer Extension合成ds cDNA
  • 1.2.4 ds cDNA的纯化和大小片段的分级分离
  • 1.2.5 cDNA与pSMART2IF载体连接
  • 1.2.6 制备电击感受态细胞DH5α
  • 1.2.7 连接产物的转化
  • 1.2.8 初始文库滴度测定
  • 1.2.9 文库插入片段长度检测与重组率检测
  • 1.3 异黄酮合成酶(IFS)基因克隆
  • 1.3.1 膜荚黄芪总RNA的提取
  • 1.3.2 IFS基因cDNA末端快速扩增
  • 1.3.3 IFS基因编码序列的扩增
  • 1.3.4 PCR产物的T载体克隆
  • 1.3.5 野生膜荚黄芪不定根的培养
  • 1.3.6 IFS基因的表达特性分析
  • 1.4 转IFS基因生菜
  • 1.4.1 植物材料
  • 1.4.2 主要基本培养基
  • 1.4.3 IFS基因对生菜的遗传转化及抗性植株的筛选
  • 1.4.4 转IFS基因生菜植株的检测
  • 2 结果与分析
  • 2.1 野生膜荚黄芪cDNA文库构建
  • 2.1.1 cDNA文库构建总RNA的提取
  • 2.1.2 野生膜荚黄芪ds cDNA的纯化和分离
  • 2.1.3 cDNA文库的质量评价
  • 2.2 野生膜荚黄芪IFS基因全长的克隆
  • 2.2.1 克隆IFS基因总RNA的提取
  • 2.2.2 膜荚黄芪IFS基因3'-RACE
  • 2.2.3 膜荚黄芪IFS基因5'-RACE
  • 2.2.4 膜荚黄芪IFS基因编码序列的克隆
  • 2.3 野生膜荚黄芪IFS基因的生物信息学分析
  • 2.3.1 膜荚黄芪IFS基因的全长cDNA序列
  • 2.3.2 膜荚黄芪IFS基因的蛋白质序列分析
  • 2.4 野生膜荚黄芪IFS基因的表达特性分析
  • 2.4.1 野生膜荚黄芪叶片和不定根不同时期RNA的提取
  • 2.4.2 不同时期IFS的半定量分析
  • 2.5 转IFS基因生菜结果分析
  • 2.5.1 植物表达载体的构建和鉴定
  • 2.5.2 植物表达载体的农杆菌转化及鉴定
  • 2.5.3 生菜的遗传转化
  • 2.5.4 转基因生菜植株的PCR鉴定
  • 3 讨论
  • 4 结论
  • 参考文献
  • 致谢
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