重组凋亡融合蛋白TRAIL-Fc在CHO中的表达、纯化及生物学活性研究

论文摘要

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（tumor necrosis factor related apoptosis inducing ligand,TRAIL）是由Wiley于1995年首次克隆并鉴定的一个能够诱导肿瘤细胞凋亡的TNF家族新成员。TRAIL对正常细胞无毒害作用,能够选择性杀伤肿瘤细胞,因此成为肿瘤治疗研究的热点,也有望成为一种新型的抗肿瘤药物。目的:本论文通过高密度培养CHO工程细胞株获得重组TRAIL-Fc融合蛋白,建立TRAIL-Fc纯化中试工艺并对其理化性质和生物学活性进行研究,为TRAIL-Fc最终应用于临床进行肿瘤治疗奠定实验基础。方法:（1） CHO工程菌无血清驯化:通过逐步降低血清和直接降血清两种驯化方法获得可在无血清培养基中稳定生长的细胞株。为提高细胞株生长密度和活率对无血清培养基进行添加物优化。（2） 5L反应器培养:采用分批补料式培养,研究温度、pH、溶氧控制及细胞生长代谢情况,探索CHO-TFc在5L反应器中的发酵工艺。TRAIL-Fc融合蛋白纯化工艺:利用Protein A亲和层析柱、CM离子交换层析柱纯化目的蛋白,并对目的蛋白进行理化性质研究。（3） TRAIL-Fc融合蛋白生物学活性:采用MTT法检测TRAIL-Fc融合蛋白体外对多株肿瘤细胞的生长抑制作用。建立H22小鼠肝癌模型,检测TRAIL-Fc融合蛋白对体内肿瘤细胞生长抑制作用。结果:（1）最终确定以逐步降血清法对CHO-TFc细胞株进行悬浮驯化,获得能在无血清培养基中稳定悬浮生长的细胞株。（2）对无血清培养基进行优化,选择在无血清培养基中添加20ng/mlIGF-1。（3） 5L反应器发酵工艺研究,以葡萄糖浓度及细胞密度为参数来确定补料策略。细胞以2.0×106cell/ml的密度接种,生长期葡萄糖浓度控制为2g/L,当细胞密度达到6-8×106cell/ml时,降温至32℃进行表达,控制残糖量为0.5g/L,最终发酵表达量为80-100mg/L。（4）建立稳定的纯化工艺,纯度可达90%以上。质谱及Western blotting结果显示,TRAIL-Fc融合蛋白结构正确。体内外活性测定结果显示,TRAIL-Fc融合蛋白具有较强的肿瘤生长抑制的作用,且其在体内的半衰期明显延长。结论:成功完成CHO-TFc工程菌株悬浮驯化,建立5L发酵及纯化工艺,获得高纯度的TRAIL-Fc融合蛋白,并对制备的目的蛋白进行了体内外活性检测,证实了其潜在的肿瘤治疗价值。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 英文缩略表
• 第一章 引言
• 一、 TRAIL 的研究进展
• 1.1 TRAIL 结构及其功能
• 1.2 TRAIL 受体
• 1.3 TRAIL 诱导细胞凋亡机制
• 1.4 重组TRAIL 国内外研究现状
• 1.5 TRAIL 在肿瘤治疗中的应用
• 二、 动物细胞大规模培养技术概况
• 2.1 动物细胞大规模培养技术应用
• 2.2 动物细胞大规模培养问题及对策
• 2.3 促蛋白表达策略
• 三、 无血清培养基的发展及CHO 细胞培养
• 3.1 无血清培养基的发展
• 3.2 无血清培养基的组成及其主要补充因子
• 3.3 CHO 细胞的无血清培养
• 四、 本课题立题依据、目的、主要内容
• 第二章 CHO 工程细胞的大规模培养
• 前言
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 细胞株
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 主要试剂
• 2.1.4 材料和仪器
• 2.1.5 主要溶液配方
• 2.2 细胞培养方法
• 2.2.1 细胞复苏
• 2.2.2 换液
• 2.2.3 传代
• 2.2.4 细胞冻存
• 2.3 CHO-TFc 无血清驯化培养
• 2.3.1 逐步降血清
• 2.3.2 直接降血清
• 2.3.3 无血清培养条件优化
• 2.4 CHO-TFc 分批补料式培养
• 2.4.1 种子细胞培养
• 2.4.2 5L 反应器培养
• 2.4.2 反应器参数操作及控制
• 2.5 分析方法
• 2.5.1 细胞计数
• 2.5.2 葡萄糖浓度测定
• 2.5.3 融合蛋白表达量测定
• 2.6 结果
• 2.6.1 细胞无血清驯化过程
• 2.6.2 无血清培养条件优化
• 2.6.3 细胞5L 反应器分批补料式培养
• 2.7 讨论
• 第三章 TRAIL-Fc 纯化工艺
• 前言
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 主要试剂
• 3.1.2 主要仪器
• 3.1.3 主要试剂配制
• 3.2 方法
• 3.2.1 超滤、浓缩
• 3.2.2 Protein A 亲和层析纯化
• 3.2.3 CM Sepharose f.f 层析实验法
• 3.3 纯化蛋白理化性质检测
• 3.3.1 SDS-PAGE 凝胶电泳检测
• 3.3.2 蛋白含量测定 Lowry 法
• 3.3.3 分子量测定
• 3.3.4 Western Blotting 检测
• 3.3.5 糖基化检测
• 3.4 结果及讨论
• 3.4.1 超滤
• 3.4.2 融合蛋白的Protein A 亲和柱层析
• 3.4.3 融合蛋白的CM 柱层析
• 3.4.4 分子量结果
• 3.4.5 免疫印迹结果
• 3.4.6 糖基化分析
• 3.5 讨论
• 第四章 TRAIL-Fc 的活性检测
• 前言
• 4.1 实验材料
• 4.1.1 细胞株
• 4.1.2 试剂
• 4.1.3 材料和仪器
• 4.1.4 实验动物
• 4.2 方法
• 4.2.1 体外抗肿瘤活性
• 4.2.2 体内抗肿瘤活性
• 4.3 结果
• 4.3.1 TRAIL-Fc 融合蛋白的体外抗肿瘤活性
• 4.3.2 TRAIL-Fc 融合蛋白的体内抗肿瘤活性
• 4.4 讨论
• 第五章 结论
• 致谢
• 参考文献
• 个人简历、在学期间发表的学术论文及取得的研究成果