囊泡转运步骤的分辨及其调控机制研究

论文摘要

囊泡的转运和融合涉及多个步骤和复杂的蛋白质相互作用。这些蛋白质相互作用的时间和位点目前尚不清楚。一个主要的技术障碍是无法以较高的空间和时间分辨率确定囊泡转运和融合过程中的不同步骤,因而不能揭示每个步骤具体的分子调控机制。利用全内反射荧光显微镜的优势,用荧光蛋白特异性地标记了胞内囊泡,并在活细胞中对囊泡进行了实时追踪,研究比较了囊泡在转运融合过程中经过的不同步骤以及分子调控机制。本文比较了GTP触发的胞吐和Ca2+触发的胞吐机制差异,并且发展了区分囊泡在转运融合过程中经过的不同步骤的方法,研究了具有重要生理意义的胰岛素诱导的葡萄糖转运蛋白4的转运过程和调控机制。在细胞内除了存在Ca2+触发的胞吐外,还存在一类不需要Ca2+,由GTP依赖的信号通路触发的胞吐。但是对于这一类不依赖Ca2+的胞吐机制了解的还非常少。在本研究中,利用双通道的全内反射荧光显微镜以PC12细胞为模型,比较了高K+溶液刺激下Ca2+触发的和Mastoparan（Mas）刺激下的致密核心大囊泡的运动特性和融合机制。本研究发现Mas刺激胞吐的囊泡主要都是一些没有锚定的在胞浆中运动的囊泡,而对已经锚定的囊泡没有什么作用;Ca2+触发的主要是一些已经锚定的囊泡。融合动力学分析和碳纤电极的数据显示Mas刺激的融合都是短暂的‘kiss and run’的方式,只能释放少量的囊泡内含物;在Ca2+触发下,融合孔开放状态持续的时间要长些,可以释放更多的囊泡内含物。并且在Mas的刺激下,囊泡一旦靠近细胞膜在很短的时间内就可以具有分泌的能力。研究结果表明,Ca2+和GTP触发胞吐的差异不仅体现在触发和最后的融合过程,也存在于囊泡的锚定和启动过程。葡萄糖转运蛋白4（GLUT4）是唯一一个响应胰岛素刺激转运上膜的葡萄糖转运蛋白家族成员。尽管它在胰岛素作用下的转运上膜是血糖调控的一个重要过程,对于胰岛素的调控机制的研究取得了一定的进展,但始终缺少很好的功能检测方法可以将GLUT4储存囊泡转运及融合过程中所经过的一系列过程区分开来,因此不能清楚解释整个过程中的分子调控机制以及胰岛素调控的关键步骤。在本研究中,开发了一个可以自动区分并系统的研究在3T3-L1脂肪细胞中,囊泡锚定、启动、融合过程的方法,并且发现了胰岛素在提高囊泡锚定速率的同时,更关键的调控步骤是在囊泡锚定在细胞膜下之后,使囊泡具有融合能力的启动过程。进一步,还发现胰岛素激活的PI3K及其下游效应物AS160调控了囊泡的锚定过程。将这个方法和分子生物学的方法结合起来,将会大大地促进我们对胰岛素调控GLUT4转运的分子机制的研究。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 绪论
• 1.1 囊泡转运和细胞分泌
• 1.2 囊泡转运和膜蛋白的转运
• 1.3 本研究的主要内容
• 2 实验原理和研究方法
• 2.1 全内反射荧光显微镜
• 2.2 共聚焦激光扫描显微镜
• 2.3 膜电容检测技术
• 2.4 碳纤电极安培测量技术
• 2.5 钙离子光解释放的原理
• 2.6 电穿孔的实验原理
• 2＋刺激下和GTP 刺激下大囊泡胞吐性质的差异研究'>3 在Ca^2＋刺激下和GTP 刺激下大囊泡胞吐性质的差异研究
• 3.1 前言
• 3.2 实验材料和实验方法
• 3.3 实验结果
• 3.4 讨论
• 4 葡萄糖转运蛋白4 转运步骤的解析及胰岛素的调控位点
• 4.1 前言
• 4.2 实验材料和实验方法
• 4.3 实验结果
• 4.4 讨论
• 5 胰岛素信号通路中P13K 和A5160 的调控机制
• 5.1 前言
• 5.2 实验结果
• 5.3 讨论
• 致谢
• 参考文献
• 附录1 攻读学位期间发表的论文目录
• 附录2 主要符号和缩略词表