Lactococcus lactis食品级诱导表达系统构建及铜绿假单胞菌融合外膜蛋白的表达

论文摘要

乳酸菌是在食品、医药等领域广泛应用的微生物，用乳酸菌构建以非抗生素抗性为选择标记的食品级载体的研究越来越为人们所关注。 NICE（The Nisin-Controlled Expression）系统是有效的食品级诱导表达系统。乳酸菌NICE系统是在乳链菌肽诱导下由nisA启动子控制目的基因的表达，含nisR和nisK的两组分调节系统的高效诱导表达系统。由于NICE系统的诱导剂、宿主菌和载体都是食品级的，构建乳酸菌NICE系统食品级表达载体，将集益生菌生物功能和外源基因表达产物活性于一体，在食品和医药方面有着很好的应用前景。在目的蛋白生产和发酵中，由于乳酸菌分泌表达可使乳酸菌生产的异源蛋白质前体避免水解，异源蛋白质表达量更高，以同源的乳酸球菌SPUsp45指导目的蛋白的分泌表达并且目的基因与SPUsp45，Nuc和LEISSTCDA的融合体可提高分泌表达效率，因而乳酸菌分泌表达更有意义。本研究利用食品级a-aga选择标记代替抗生素抗性选择标记，并利用nisA启动子、nisR、nisK和SPUsp45／nucA／cwaM6／t1t2基因，以乳酸球菌作为宿主菌，以乳链菌肽作为诱导分子，构建更为安全稳定的乳酸菌食品级高效诱导细胞质和细胞分泌表达的θ型复制载体系统。OprF／H为本实验室构建，是铜绿假单胞菌外膜蛋白组分F和H的融合蛋白，具有良好的免疫原性，为检测该系统的可行性，将OprF／H基因克隆入构建的载体中，在乳酸球菌中进行高效诱导细胞内和细胞壁分泌表达，为利用此两种载体表达各种外源性和内源性的功能基因提供理论和技术依据，同时也为研制有效的防治铜绿假单胞菌的新型疫苗提供思路。从L.lactis SMQ719／pRAF800中提取到食品级载体pRAF800，根据公布的pRAF800的复制子序列，设计引物扩增rep基因，经限制酶EcoRI和NheI酶切，利用T4连接酶与pMG36e的Emr连接。连接产物用电转化法转入L.lactis NZ9000中，经Em筛选、克隆子鉴定，获得重组质粒pEmr：rep。用限制酶Hind III酶切pEmr：rep，pEmr：rep经绿豆核酸酶削平，T4连接酶连接，获得含Emr的θ复制子缺失载体pEmr：Arep。然后以pNZ8048 DNA为模板，根据已发表的PnisA和TpepN序列，设计引物扩增出大小为312bp的PnisA-MCS-TpepN基因片段，再用限制酶XbaI酶切pRAF800

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摘要

ABSTRACT

缩略语表

第一章文献综述

1 乳酸菌与食品级载体

2 乳酸菌食品级载体选择标记

2.1 显性选择标记

r选择标记'>2.1.1 Nis^r选择标记

2.1.2 LafI选择标记

2.1.3 代谢糖类选择标记

2.1.4 噬菌体抗性选择标记

2.1.5 其他显性选择标记

2.2 互补选择标记

2.2.1 alr互补选择标记

2.2.2 lacF互补选择标记

2.2.3 supD食品级互补选择标记系统

2.3 两组分食品级选择标记

3 食品级高效诱导表达系统—NICE系统

3.1 nisin生物合成基因与NICE系统的提出

3.2 NICE系统的构建及原理

3.3 NICE系统的特点

3.4 NICE系统的应用前景

4 乳酸菌蛋白质分泌表达研究进展

4.1 分泌表达载体的发展

4.2 分泌表达可避免蛋白分解作用

4.3 分泌表达的蛋白质的稳定性

4.4 展望

第二章乳酸菌两组分食品级选择标记复制子缺失质粒的构建

1 引言

2 料和方法

2.1 材料

2.1.1 菌株、质粒

2.1.2 主要生化试剂

2.1.3 引物：

2.1.4 实验设备

2.1.5 培养基,抗生素以及常用溶液的配制

2.2 方法

2.2.1 菌株培养

2.2.2 质粒提取

2.2.3 紫外分光光度法测定目的基因与载体的浓度

2.2.4 琼脂糖电泳鉴定DNA

2.2.5 PCR产物的割胶回收或从溶液中回收纯化

2.2.6 回收酶切后的大片段

2.2.7 PCR扩增rep基因

2.2.8 限制性酶切：

2.2.9 构建克隆载体：

2.2.10 连接产物的电转化和筛选

2.2.11 转化子的复制子缺刻

3 结果与讨论

3.1 L.lactis SMQ719／pRAF800质粒提取及rep扩增

r'>3.2 pMG36e的提取及酶切回收Em^r

r的连接转化'>3.3 rep和Em^r的连接转化

3.4 克隆子的筛选

r：rep质粒的PCR检测和酶切鉴定'>3.5 pEm^r：rep质粒的PCR检测和酶切鉴定

r：Arep质粒的构建'>3.6 pEm^r：Arep质粒的构建

r：rep的酶切、削平及连接'>3.6.1 pEm^r：rep的酶切、削平及连接

r：△rep质粒的检测'>3.6.2 pEm^r：△rep质粒的检测

4 小结

第三章乳酸菌两组分食品级诱导表达系统载体的构建

1 引言

2 材料和方法

2.1 材料

2.1.1 菌株、质粒

2.1.2 主要生化试剂

2.1.3 引物

2.1.4 实验设备

2.1.5 常规培养基及溶液的配制

2.2 方法

2.2.1 菌株培养

2.2.2 高纯度质粒中量提取方法

2.2.3 紫外分光光度法测定目的基因与载体的浓度

2.2.4 琼脂糖电泳鉴定DNA

2.2.5 PCR产物的割胶回收或从溶液中回收纯化

2.2.6 回收酶切后的大片段

nisA-MCS-T_pepN片段的PCR扩增'>2.2.7 P_nisA-MCS-T_pepN片段的PCR扩增

2.2.8 限制性酶切

2.2.9 目的基因与载体的连接用T4连接酶连接

2.2.10 乳酸菌的电穿孔转化和筛选

2.2.11 重组载体pRNA48的鉴定

3 结果与讨论

3.1 L. lactis NZ9000／pNZ8048与L. lactis SMQ719／pRAF800的质粒提取

nisA-MSC-T_pepN的PCR'>3.2 P_nisA-MSC-T_pepN的PCR

nisA-MSC-T_pepN基因的克隆及克隆子的筛选'>3.3 P_nisA-MSC-T_pepN基因的克隆及克隆子的筛选

3.4 pRNA48的鉴定

3.4.1 质粒大小比较法鉴定重组质粒

3.4.2 pRNA48的PCR鉴定

3.4.3 pRNA48的限制酶酶切鉴定内切酶图谱鉴定

3.4.4 克隆入pRNA48的目的基因的测序

4 小结

第四章乳酸菌两组分食品级诱导表达系统分泌表达载体的构建

1 前言

2 材料和方法

2.1 材料

2.1.1 菌株、质粒

2.1.2 主要生化试剂

2.1.3 引物

2.1.4 实验设备

2.1.5 常规培养基及溶液的配制

2.2 方法

2.2.1 菌株培养

2.2.2 高纯度质粒中量提取方法

2.2.3 紫外分光光度法测定目的基因与载体的浓度

2.2.4 琼脂糖电泳鉴定

2.2.5 PCR产物的割胶回收或从溶液中回收纯化

2.2.6 回收酶切后的大片段

Usp45-nucA-cwa_M6-t1t2片段的PCR扩增'>2.2.7 SP_Usp45-nucA-cwa_M6-t1t2片段的PCR扩增

2.2.8 限制性酶切

2.2.9 目的基因与载体的连接用T4连接酶连接

2.2.10 乳酸菌的电穿孔转化和筛选

2.2.11 重组载体pRNV48的鉴定

Usp45-nucA-cwa_M6-t1t2的T／A克隆和测序'>2.2.12 克隆入pRNV48的SP_Usp45-nucA-cwa_M6-t1t2的T／A克隆和测序

2.2.13 Nuc的诱导表达

2.2.14 Nuc活性检测方法

3 结果与讨论

3.1 pRNV48的构建

3.1.1 L. lactis MG1363／pVE5524和L. lactis NZ9000／pRNA48的质粒提取

Usp45-nucA-cwa_M6-t1t2片段的PCR'>3.1.2 SP_Usp45-nucA-cwa_M6-t1t2片段的PCR

3.1.3 基因的连接、转化及克隆子的筛选

3.1.4 pPNV48的鉴定

3.2 Nuc在L. lactis NZ9000中高效诱导分泌表达的初步研究

4 小结

第五章细胞内表达载体pRNA48-OprF／H的构建及细胞内表达初步研究

1 前言

2 材料和方法

2.1 材料

2.1.1 菌株、质粒

2.1.2 主要生化试剂

2.1.3 引物

2.1.4 实验设备

2.1.5 常规培养基及溶液的配制

2.2 方法

2.2.1 菌株培养

2.2.2 高纯度质粒中量提取方法

2.2.3 紫外分光光度法测定目的基因与载体的浓度

2.2.4 琼脂糖电泳鉴定DNA

2.2.5 PCR产物的割胶回收或从溶液中回收纯化

2.2.6 回收酶切后的大片段

2.2.7 OprF／H的PCR扩增

2.2.8 限制性酶切

2.2.9 目的基因与载体的连接

2.2.10 乳酸菌的电穿孔转化和筛选

2.2.11 重组载体pRNA48-OprF／H的鉴定

2.2.12 克隆入pRNA48的目的基因（OprF／H）的T／A克隆和测序

2.2.13 OprF／H的诱导表达

3 结果与讨论

3.1 pRNA48-OprF／H的构建

3.1.1 L. lactis NZ9000／pRNA48和E. coli BL21／pGEX-OprF／H的质粒提取

3.1.2 OprF／H片段的PCR

3.1.3 OprF／H基因的克隆及克隆子的筛选

3.1.4 pRNA-OprF／H48的鉴定

3.1.5 克隆入pRNA48的目的基因（OprF／H）的测序

3.2 OprF／H在L. lactis NZ9000中高效诱导表达的初步研究

4 小结

第六章分泌表达载体pRNV48-OprF／H的构建、锚定表达以及表达蛋白的活性检测

1 前言

2 材料和方法

2.1 材料

2.1.1 菌株、质粒和实验动物

2.1.2 主要生化试剂

2.1.3 引物

2.1.4 实验设备

2.1.5 常规培养基及溶液的配制

2.2 方法

2.2.1 菌株培养：

2.2.2 高纯度质粒中量提取方法

2.2.3 紫外分光光度法测定目的基因与载体的浓度

2.2.4 琼脂糖电泳鉴定

2.2.5 PCR产物的割胶回收或从溶液中回收纯化

2.2.6 回收酶切后的大片段

2.2.7 OprF／H片段的PCR扩增

2.2.8 限制性酶切

2.2.9 目的基因与载体的连接

2.2.10 乳酸菌的电穿孔转化和筛选

2.2.11 重组载体pRNV48的鉴定

2.2.12 克隆入pRNV48的目的基因（OprF／H）的T／A克隆和测序

2.2.13 OprF／H的诱导表达

2.2.14 目的蛋白的免疫原性和免疫保护性研究方法

3 结果与讨论

3.1 pRNV48-OprF／H的构建

3.1.1 L. lactis NZ9000／pRNV48和E coli BL21／pGEX-OprF／H的质粒提取

3.1.2 OprF／H片段的PCR

3.1.3 OprF／H片段基因的克隆及克隆子的筛选

3.1.4 pRNV-OprF／H48的鉴定

3.1.5 目的基因的测序

3.2 OprF／H在L. lactis NZ9000中高效诱导细胞壁锚定表达的初步研究

3.3 目的蛋白OprF／H的免疫原性的初步研究

3.3.1 直接凝集反应

3.3.2 抗体血清滴度的测定

3.3.3 Western-blot初步分析OprF／H的抗原性

4 小结

第七章主要研究结果和建议

1 研究结果

2 建议

参考文献：

nisA-MCS-T_pepN（pRNA48）测序序列'>附录1：P_nisA-MCS-T_pepN（pRNA48）测序序列

nisA-MCS-T_pepN（pRNB48）测序序列'>附录2：P_nisA-MCS-T_pepN（pRNB48）测序序列

Usp45-nucA-cwa_M6-t1t2（pRNV48）测序序列'>附录3：SP_Usp45-nucA-cwa_M6-t1t2（pRNV48）测序序列

附录4：oprF／H（pRNA48-oprF／H）测序序列

附录5：oprF／H（pRNV48-oprF／H）测序序列

nisA-MCS-T_pepN（pRNA48）测序图谱'>附录6：P_nisA-MCS-T_pepN（pRNA48）测序图谱

nisA-MCS-T_pepN（pRNB48）测序图谱'>附录7：P_nisA-MCS-T_pepN（pRNB48）测序图谱

Usp45-nucA-cwa_M6-t1t2（pRNV48）测序图谱'>附录8：SP_Usp45-nucA-cwa_M6-t1t2（pRNV48）测序图谱

附录9：oprF／H（pRNA48-oprF／H）测序图谱

附录10：oprF／H（pRNV48-oprF／H）测序图谱

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