陆地棉黄萎病抗性的遗传分析与QTLs定位

论文摘要

棉花是世界上最重要的经济作物,在我国国民经济中占有重要地位。棉花黄萎病是分布于世界各主要产棉国家的主要病害,严重威胁和阻碍着棉花的生产与发展。近年来,棉花黄萎病在我国各大棉区连续流行危害,且有逐年加重的趋势,对棉花生产造成了极大危害.实践证明,培育抗病品种是解决这一问题的根本途径。棉花黄萎病一直是我国抗病遗传育种的研究重点,但到目前为止,在生产上还没有一个真正抗病的品种。几十年来国内外在棉花抗黄萎病育种工作中没有取得明显的突破,原因主要有三个：没有突出的抗源材料,棉花黄萎病抗性遗传规律不清,病原菌的分布、致病力及小种分化不清。因此深入开展棉花抗黄萎病的遗传研究,寻找与抗病基因紧密连锁的分子标记,了解黄萎病菌侵染棉株的动态过程,研究大丽轮枝菌在各抗,感材料组织中的分布进而明确各材料对黄萎病的抗感机理,培育稳定高抗的抗黄萎病棉花新品种具有重要的意义。本研究采用主基因+多基因混合遗传模型和六个世代联合分析的方法对陆地棉栽培品种的抗黄萎病性进行遗传分析,应用复合区间作图方法检测定位抗黄萎病QTLs,阐明陆地棉抗黄萎病性的遗传规律、主效抗病基因及在染色体上分布特点；通过构建GFP基因在真菌中的表达载体,转化黄萎病菌,实现GFP基因在黄萎病菌中表达,为进一步阐明黄萎病菌侵染棉株的动态过程提供检测标记。主要研究结果如下：一、陆地棉黄萎病抗性遗传分析利用抗黄萎病陆地棉品系5026和60182与感病品种军棉1号作为亲本,配制了P1、P2、F1、B1、B2和F26个世代.分别接种非落叶型黄萎病菌株BP2,落叶型黄萎病菌株VD8和T9,以及它们的等浓度混合病菌,调查了6世代的病叶比例性状的表型分布。运用主基因+多基因混合遗传模型和6个世代联合分析的方法,对抗病性进行遗传分析。结果表明,陆地棉5026对非落叶型黄萎病菌株的抗性受2对主基因+多基因共同控制；对落叶型黄萎病菌株和落叶型、非落叶型混合病菌的抗性受1对主基因+多基因控制；陆地棉60182在接种BP2、VD8、T9和其混合菌系时,抗病性都符合两对主基因+多基因遗传模式。5026和60182品系抗黄萎病性状在各个分离世代均以主基因遗传为主。二、陆地棉品种间分子标记遗传连锁图构建本研究用陆地棉抗病品系60182与陆地棉感病品种军棉1号为亲本材料,获得了229个F2单株为作图群体，进行抗黄萎病性状的分子标记筛选。用6771对SSR引物筛选亲本间的多态。用Joinmap3.0软件对符合要求的191个位点进行连锁关系分析。得到一张含139个位点、31个连锁群、全长1165.1cM,覆盖棉花基因组25.88%,标记间平均距离为8.38cM的陆地棉品种间分子标记遗传连锁图,根据本实验室已经构建的一张海陆种间遗传图谱,可以把其中22个连锁群初步定位到相应的染色体上。这一连锁图为检测黄萎病抗性基因打下了良好的基础。三、陆地棉抗黄萎病分子标记定位对F2：3家系材料分别在六月,七月调查叶片病级,十二月调查维管束病级,获得不同生育时期的田间抗病数据。将F2：3家系材料的田间抗病数据结合分子标记连锁图谱标记信息,通过复合区间作图的方法检测抗黄萎病QTLs.结果如下：接种非落叶型黄萎病菌BP2共检测到8个QTLs。在D7染色体上定位到4个QTLs,其中在苗期六月检测到1个,解释24.1%的表型变异；在苗期七月定位到2个,分别解释5.8%和13.6%的表型变异；在成熟期检测到1个QTLs,解释32.0%的表型变异。在D9染色体上定位到4个QTLs,其中在苗期六月和苗期七月检测到1个共同的QTLs,分别解释表型变异24.5%和19.8%；在苗期六月和成熟期也检测到1个共同的QTLs,分别解释表型变异5.9%和10.5%；另外,在苗期七月定位到1个QTLs,解释7.8%的表型变异,成熟期检测到1个QTLs,解释25.3%的表型变异。接种落叶型黄萎病菌VD8共检测到14个QTLs.在D7染色体上定位到5个QTLs,其中在苗期六月和苗期七月检测到1个共同的QTLs,分别解释表型变异30.8%和12.1%；在苗期七月定位另一个QTLs,解释7.5%的表型变异；在成熟期检测到2个QTLs,分别解释31.5%和27.7%的表型变异。在D9染色体上定位到9个QTLs,其中在苗期六月、七月和成熟期检测到1个共同的QTLs,分别解释16.5%、16.8%和11.6%的表型变异；在苗期六月和苗期七月也检测到1个共同的QTLs,分别解释表型变异11.9%和32.1%；在苗期六月检测到1个QTLs,解释11.8%的表型变异；在苗期七月定位到1个QTLs,解释15.7%的表型变异；成熟期检测到2个QTLs,分别解释13.1%和18.6%的表型变异。接种落叶型黄萎病菌T9共检测到9个QTLs.在D7染色体上定位到4个QTLs,其中在苗期六月和苗期七月检测到1个共同的QTLs,分别解释表型变异19.1%和10.2%；在苗期七月定位另一个QTLs,解释16.5%的表型变异；在成熟期检测到1个QTLs,解释24.0%的表型变异。在D9染色体上定位到5个QTLs,其中在苗期六月和苗期七月检测到1个共同的QTLs,分别解释表型变异13.0%和18.8%；另外苗期六月还检测到1个QTLs,解释20.2%的表型变异；成熟期检测到2个QTLs,分别解释19.3%和11.8%的表型变异。接种混合病菌共检测到10个QTLs.在D7染色体上定位到3个QTLs,其中在苗期六月检测到1个QTLs,解释表型变异24.6%；在苗期七月定位到1个QTLs,解释33.4%的表型变异；在成熟期检测到1个QTLs,分别解释23.4%的表型变异。在D9染色体上定位到7个QTLs,其中在苗期六月和成熟期检测到2个共同的QTLs,一个解释表型变异23.1%和9.0%；另一个解释12.7%和33.2%的表型变异；另外苗期七月检测到2个QTLs,解释9.7%和20.6%的表型变异；成熟期检测到1个QTLs,解释8.9%的表型变异。在检测到的所有QTLs中,发现3个广谱抗性QTLs兼抗BP2、VD8、T9和三者的混合菌；1个BP2特异抗性的QTLs;1个VD8特异抗性的QTLs;1个落叶型黄萎病菌抗性QTLs和2个混合型黄萎病菌抗性QTLs.综合分析这些QTLs在染色体上的的分布特点发现：60182抗不同黄萎病菌的QTLs非常一致地集中在染色体D7和D9上,但不同致病力的病菌接种后检测到的QTLs位于染色体的不同区间。陆地棉抗黄萎病品种60182的D7和D9染色体上成簇分布抗不同致病力的抗性QTLs充分表明60182兼具对落叶型,非落叶型黄萎病菌株的广谱抗性。四、绿色荧光蛋白转化黄萎病菌构建了GFP基因在真菌中的表达载体,并转化黄萎病菌系VD8。选择标记的抗性筛选获得瞬时表达GFP的阳性克隆.进一步的外源基因的整合和稳定表达研究还需进一步验证。该转GFP基因的VD8黄萎病菌系将被用于跟踪黄萎病菌侵染棉株的动态过程,为阐明不同棉花资源材料对黄萎病的抗感机理提供证据.

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 本文所用主要缩略词
• 第一章 文献综述
• 1 棉花黄萎病的分布与危害
• 2 棉花黄萎病菌
• 2.1 种的鉴定
• 2.2 生理型的划分
• 2.3 营养亲和群研究
• 2.4 致病力的研究
• 2.5 分子生物学鉴定
• 2.6 致病机理的研究
• 2.7 寄主范围
• 2.8 适宜环境
• 3 棉花对黄萎病的抗性
• 3.1 寄主与病原菌的识别作用
• 3.2 棉花组织结构抗性
• 3.3 棉花的生理生化抗性
• 3.4 棉花黄萎病抗性的鉴定方法
• 4 棉花抗黄萎病遗传
• 5 棉花抗黄萎病育种
• 6 植物分子标记研究进展
• 6.1 分子标记种类
• 6.2 遗传作图
• 6.3 植物QTLs检测方法
• 6.4 棉花QTLs作图研究进展
• 7 绿色荧光蛋白（GFP）在真菌研究中的应用
• 7.1 GFP随机插入真菌基因组在真菌研究中的应用
• 7.2 GFP与目的基因融合在真菌分子生物学研究中的应用
• 7.3 GFP与基因文库结合用于基因组的研究
• 7.4 GFP在真菌研究中的应用展望
• 8 本研究的目的和内容
• 第二章 陆地棉黄萎病抗性遗传分析
• 1 植物材料与病原菌
• 1.1 棉花品种
• 1.2 黄萎病菌系
• 2 试验方法
• 2.1 抗病性鉴定方法
• 2.2 杂交组合配制
• 3 数据分析原理与方法
• 4 结果与分析
• 4.1 陆地棉60182抗黄萎病性状的遗传分析
• 4.2 陆地棉5026抗黄萎病性状的遗传分析
• 5 讨论
• 第三章 陆地棉抗黄萎病分子标记定位研究
• 1 材料和方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 试验方法
• 1.3 棉花叶片DNA的提取
• 1.4 引物的来源与标记分析
• 1.5 数据分析
• 1.6 QTLs的命名方法
• 2 结果与分析
• 2.1 亲本及群体的性状表现
• 2.2 图谱的构建
• 2.3 QTLs定位分析
• 3 讨论
• 第四章 绿色荧光蛋白（GFP）基因转化黄萎病菌研究
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 本研究的技术路线
• 1.3 植物表达载体的构建
• 1.4 GFP真菌表达载体的农杆菌转化
• 1.5 农杆菌介导黄萎病菌株VD8的遗传转化
• 2 结果与分析
• 2.1 GFP真菌表达载体的构建与鉴定
• 2.2 荧光检测
• 3 讨论
• 全文结论
• 参考文献
• 攻读博士学位期间发表和待发表的论文
• 致谢