维甲酸致昆明小鼠腭裂发生过程中RARα、Dishevelled2、Vangl2和β-catenin蛋白表达状况的实验研究

论文摘要

目的腭裂是一种发病率较高并为人们关注的一种先天性颌面部发育缺陷,一般认为,病因为基因和环境因素的联合作用。腭的形成是一个极其复杂生物学过程,受到诸多基因的严密调控,其中任何相关基因的表达异常,都可能导致腭裂的发生。RA是维生素A在体内的自然活性代谢物,也是胚胎发育过程中不可缺少的形态发生素。在小鼠腭组织发育敏感期,RA可诱发子代发生腭裂。在腭裂发生过程中RARα起关键作用,RA可以通过调节RARα在鼠胚继发腭中的表达参与腭的形态发生。Wnt蛋白是一类由Wnt基因编码的分泌型糖蛋白,通过与细胞膜上相关受体和蛋白相互作用启动Wnt信号传导,与胚胎发育及器官形成等密切相关。β-catenin是经典Wnt信号途径中不可缺少的关键性效应分子,参与颅面部形态发生等一系列生物学过程,其表达失调可致颅面部发育缺陷和面部模式形成障碍。Dishevelled蛋白是胞质内多条Wnt信号转导途径的衔接子,Vangl2蛋白也是该信号通路中不可缺少的关键分子成员,与许多其他相关基因的蛋白质产物共同构成一条极为复杂的控制胚胎发育、细胞命运及组织器官形态发生的细胞信号通路,其异常激活将导致各种先天畸形。本研究以昆明小鼠为研究对象,建立RA致小鼠腭裂畸形动物模型,以改动物模型为研究对象,利用免疫组化法初步探讨RARα受体、Dishevelled2、β-catenin和Vangl2蛋白在RA致胚胎腭裂畸形发生中的表达状况和变化规律,以期阐明过量RA致腭裂的发生机制,为腭裂的预防与治疗提供实验依据。实验方法1.RA致昆明小鼠腭裂畸形动物模型的建立:下午六点昆明小鼠雌雄2:1合笼,次日早上阴栓阳性雌鼠定为孕0d天。孕鼠随机分为实验组和对照组。实验组分别于孕10 d一次性灌服60、80、100 mg/kg RA。以确定给药剂量;分别于孕8、12 d给予80 mg/kg RA,以确定给药时间。对照组于相同时间一次性灌服等量芝麻油。GD16d脱颈处死,剖宫取胎鼠,解剖显微镜下观察腭裂发生情况,部分样本常规制备石蜡切片,HE染色,光镜下观察腭裂形态结构特征。2.RARα、Dishevelled2,、β-catenin和Vangl2蛋白检测:实验组和对照组孕鼠各随机分为8小组,分别于GD138、GD1314、GD1322、GD148、GD1414、GD1422、GD158和GD15228个时间点剖宫取胚鼠,常规石蜡切片。采用SP免疫组织化学法检测RARα、β-catenin、Dishevelled2和Vangl2蛋白在各组不同时期腭板上皮和间充质的表达和分布状况。实验结果1.动物模型建立在孕10d给予80mg/kg剂量RA诱导昆明小鼠腭裂发生率最高为100%（28/28）,为理想腭裂动物模型2.RARα、Dishevelled2、Vangl2及β-catenin蛋白表达结果（1）RARα蛋白表达对照组:在腭板上皮中RARα的表达呈现先逐渐上升（GD138～GD148）,而后逐渐下降(GD148～GD1422),之后再次上升(GD1422～GD1522)的趋势,峰值出现于GD148时。间充质中的表达趋势与其在腭板上皮中的表达趋势相仿,但表达水平却明显低于上皮。实验组:腭板上皮中RARα的表达,与对照组相比,于GD1522时有一个大幅下降的过程,于GD1314～GD148时明显低于相应对照组（P＜0.01）,并于GD1522时再次降至明显低于对照组的水平（P＜0.01）。在腭板间充质,除GD1422外,各时间段实验组的表达水平均低于相应对照组,以GD1322、GD148、与GD1522更为显著（P＜0.01）。（2）Dishevelled2蛋白表达对照组:Dishevelled2蛋白在腭板上皮的表达水平明显强于其在相应时期间充质中的表达（P＜0.01,P＜0.05）。在腭板上皮,呈现先逐渐上升(GD138～GD1322),而后逐渐下降(GD1322～GD1414),之后再次上升(GD1414～GD1522)的趋势,峰值出现于GD1322时,谷值出现于GD1414时。在间充质的表达趋势与腭板上皮大体相仿,但于GD1414时有一个大幅下降的过程。实验组:Dishevelled2蛋白在间充质的表达趋势与对照组大体相仿,但于GD158时有一个大幅上升的过程。于GD138～GD1314时明显高于相应对照组,（P＜0.05）,但于GD158时再次上升至明显高于对照组的水平（P＜0.01）。腭板上皮Dishevelled2蛋白表达与其在间充质中表达基本一致。（3）Vangl2蛋白表达结果对照组:在各组腭板上皮和间充质均有不同程度的表达,呈棕黄色的阳性着色,上皮中的表达明显高于其在同时期的间充质（P＜0.01,P＜0.05）。间充质中表达呈现,先逐渐上升(GD138～GD1322),后逐渐下降(GD1322～GD1422),之后再次上升(GD1422～GD1522)的趋势。在上皮中的表达时高时低呈波浪状,无明显规律。实验组:在腭板间充质中,GD138～GD148阶段,Vangl2蛋白表达水平明显升高（P＜0.05,P＜0.01）。GD1414～GD1522时期,则仅在GD1414和GD158两个时段降至低于相应对照组的水平。在实验组腭板上皮,Vangl2表达也呈现波浪状,实验组和对照组表达水平消长互现,无明显规律性。（4）β-catenin蛋白表达结果对照组:在腭板上皮中的表达量先逐渐下降（GD138～GD148）,而后突然上升(GD1414),之后又逐渐下降(GD1422～GD1522)。峰值出现于GD1414,谷值出现于GD148。其在腭板间充质中的表达水平均明显低于其在上皮细胞中的表达水平。实验组:在腭板上皮,其表达量则呈现波浪状发展趋势,除GD1414明显低于对照组（P＜0.01）,GD158时无显著差异外,其它时间点的表达均显著增高（P＜0.01）。在腭板间充质,其表达水平波动在一个很小的范围内（0.373～0.454）,无明显规律。结论1于孕10d灌服80mg/kgRA诱导昆明小鼠腭裂是一种有效动物实验模型。2 RARα、Dishevelled2、Vangl2及β-catenin蛋白参与鼠胚腭正常发育的调控过程。3 RA可通过干扰RARα、Dishevelled2、Vangl2及β-catenin蛋白在腭发育过程中的正常表达,导致腭裂畸形的发生。

论文目录

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