冬凌草甲素长循环脂质体的研究

论文摘要

冬凌草甲素是从冬凌草中提取分离的一种四环二萜类化合物,而冬凌草是应用于临床最重要的中草药之一。半个多世纪以前,就已证实冬凌草甲素具有免疫调节、抗炎、抗病毒等作用,特别是对上呼吸道感染有很好的治疗作用。最近的实验室和临床研究表明,冬凌草甲素是有效的抗移植性肿瘤-前列腺癌、乳腺癌、大叶肺细胞癌等的药物。由于冬凌草甲素易氧化、水溶性差、生物半衰期短,限制了作为临床化疗药物的使用。论文旨在通过制备冬凌草甲素长循环脂质体,使药物在血液中滞留时间延长,浓度升高。论文对冬凌草甲素长循环脂质体制备工艺,冬凌草甲素长循环脂质体在小鼠血液和组织中的分布及冬凌草甲素长循环脂质体对荷H22肝癌小鼠的抗肿瘤作用进行了研究。首先研究了冬凌草中冬凌草甲素的提取纯化工艺。向冬凌草粉末中加入12倍量的95%乙醇,超声提取3次,每次30min。再向冬凌草乙醇提取液中加入冬凌草用量24%的活性炭超声脱色2次,每次20min。确定冬凌草甲素粗品的制备型高效液相色谱分离条件:色谱柱为μBondapackTMC18（80mm i.d×300mm,粒径25μm～40μm）;柱温:40℃;流动相:甲醇-水（50/50,V/V）;流速:60mL·min-1;检测波长:238nm;进样体积:10mL。将所收集的16min～23min的洗脱液经蒸发浓缩,真空干燥,得冬凌草甲素白色粉末,经高效液相检测纯度为99.0%,提取率65.4%。采用质谱、元素分析、紫外、红外、核磁共振和高效液相色谱鉴定和验证了提取物的化学结构。研究冬凌草甲素长循环脂质体的制备工艺和建立测定冬凌草甲素含量的高效液相色谱法。以包封率和载药量为指标,考察了大豆卵磷脂、胆固醇、冬凌草甲素和聚乙二醇2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(PEG2000-DSPE)的用量,水化介质的种类和体积,对包封率和载药量的影响。通过试验设计优化了处方及制备工艺;选用LichrospherC18柱（4.6 mmi.d×250mm,粒径5μm）,柱温40℃,以甲醇-水（70/30,V/V）为流动相,检测波长238nm,在流速1.0mL·min-1条件下进样10μL测定冬凌草甲素含量。最佳工艺为大豆卵磷脂0.26g,胆固醇0.14g,冬凌草甲素0.04g,PEG2000-DSPE 0.5g,纯净水30mL,制得的冬凌草甲素脂质体粒径在100nm～200nm之间呈正态分布,平均粒径150nm,包封率达95.4%,载药量为4.24%。体外释放结果表明,脂质体中冬凌草甲素在96h释放基本完全。确定的处方较好,工艺可行,高效液相色谱法简便、准确、快速,有利于控制冬凌草甲素脂质体的质量。同法制备了冬凌草甲素普通脂质体(脂膜中不含PEG2000-DSPE)。制备的冬凌草甲素长循环脂质体和普通脂质体在5℃进行贮存试验,80d后各项指标保持稳定,包封率基本没有变化。结果表明,冬凌草甲素长循环脂质体和普通脂质体在5℃条件下贮存稳定性良好。研究冬凌草甲素长循环脂质体和普通脂质体在小鼠体内的组织分布及药代动力学特性。采用高效液相色谱法测定小鼠血液和组织中冬凌草甲素的浓度。对冬凌草甲素长循环脂质体、冬凌草甲素普通脂质体和冬凌草甲素注射液在小鼠体内分布特点和药代动力学参数进行了比较。结果表明,冬凌草甲素长循环脂质体在肝、脾、肺、心及肾中的相对靶向率分别为2.10、1.95、1.34、2.39和0.84;冬凌草甲素普通脂质体在肝、脾、肺、心及肾中的相对靶向率分别为4.47、3.84、1.49、1.89和0.92。静脉注射冬凌草甲素长循环脂质体后药时曲线表明体内过程符合二室模型,各相半衰期分别为T1/2α＝3.18h,T1/2β＝98.36h,血药浓度.时间曲线下面积AUC0-48h＝888.91 h·μg·mL-1,中心分布容Vc＝19.17 mL·Kg-1;静脉注射冬凌草甲素普通脂质体后药时曲线表明体内过程符合二室模型,各相半衰期分别为T1/2α＝2.54h,T1/2β＝33.98h,血药浓度.时间曲线下面积AUC0-48h＝356.69 h·μg·mL-1,中心分布容Vc＝20.01mL·Kg-1;静脉注射冬凌草甲素注射液后药时曲线表明体内过程符合二室模型,各相半衰期分别为T1/2α＝0.63h,T1/2β＝6.19h,血药浓度-时间曲线下面积AUC0-48h＝156.07 h·μg·mL-1,中心分布容Vc＝10.66mL·Kg-1。冬凌草甲素长循环脂质体延长了冬凌草甲素在小鼠体内的循环时间。采用动物移植性肿瘤实验法,将H22小鼠肝癌细胞接种于昆明小鼠皮下,进行体内抑瘤试验,考察冬凌草甲素长循环脂质体、冬凌草甲素普通脂质体和冬凌草甲素注射液给药后对实体瘤的抑瘤率。结果表明,冬凌草甲素长循环脂质体、冬凌草甲素普通脂质体和冬凌草甲素注射液均具有抗肿瘤效应,与冬凌草甲素普通脂质体和冬凌草甲素注射液相比,冬凌草甲素长循环脂质体显示更强的抑瘤性,给药剂量为3.35×10-2g·Kg-1·d-1时三者抑瘤率分别为85.4%、71.4%和63.7%。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩写符号表
• 目录
• 1 绪论
• 1.1 脂质体作为药物载体的研究进展
• 1.1.1 脂质体形成原理和组成
• 1.1.2 脂质体的分类与作用特点
• 1.1.3 脂质体的制备方法
• 1.1.4 脂质体在医学领域中的应用
• 1.2 长循环脂质体作为药物载体的研究进展
• 1.2.1 长循环脂质体概述
• 1.2.2 长循环脂质体作为抗肿瘤药物的研究
• 1.2.3 长循环脂质体作为基因药物的研究
• 1.2.4 长循环脂质体用于其它药物的研究
• 1.2.5 新型长循环脂质体
• 1.3 冬凌草甲素的研究进展
• 1.3.1 理化性质
• 1.3.2 冬凌草甲素的抗肿瘤作用
• 1.3.3 药物动力学研究
• 1.3.4 提取分离与含量测定
• 1.3.5 剂型与临床研究
• 1.4 选题背景及研究内容和方法
• 1.4.1 选题背景
• 1.4.2 研究内容和方法
• 参考文献
• 2 冬凌草甲素提取分离与结构鉴定
• 2.1 材料与实验仪器
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 主要仪器
• 2.2 方法与结果
• 2.2.1 冬凌草中冬凌草甲素的含量测定
• 2.2.2 冬凌草甲素超声提取工艺研究
• 2.2.3 冬凌草醇提液的活性炭脱色工艺研究
• 2.2.4 制备型高效液相色谱法对冬凌草中冬凌草甲素的分离纯化
• 2.2.5 产物结构表征
• 2.3 讨论
• 2.3.1 关于冬凌草中冬凌草甲素的含量测定
• 2.3.2 关于超声提取
• 2.3.3 关于活性炭脱色
• 2.3.4 关于制备色谱纯化冬凌草甲素的条件
• 2.4 小结
• 参考文献
• 3 冬凌草甲素长循环脂质体制备工艺和理化性质研究
• 3.1 材料与实验仪器
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 主要试剂
• 3.1.3 主要仪器
• 3.2 方法与结果
• 3.2.1 脂质体包封率的测定
• 3.2.2 脂质体制备工艺研究
• 3.2.3 脂质体体外释药特性研究
• 3.2.4 脂质体理化性质研究
• 3.2.5 贮存温度对脂质体稳定性的影响
• 3.3 讨论
• 3.3.1 关于脂质体包封率的测定
• 3.3.2 关于脂质体的制备方法
• 3.3.3 关于脂质体体外释放度的测定
• 3.3.4 关于脂质体粒径和冬凌草甲素含量测定
• 3.3.5 关于脂质体的稳定性
• 3.4 小结
• 参考文献
• 4 冬凌草甲素长循环脂质体体内药动学及组织分布研究
• 4.1 材料、实验仪器及实验动物
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 主要试剂
• 4.1.3 主要仪器
• 4.1.4 实验动物
• 4.2 方法与结果
• 4.2.1 生物样品中冬凌草甲素测定方法研究
• 4.2.2 脂质体在小鼠体内分布和经时变化规律研究
• 4.3 讨论
• 4.3.1 关于生物样品的HPLC分析
• 4.3.2 关于药代动力学和组织分布
• 4.4 小结
• 参考文献
• 5 冬凌草甲素长循环脂质体的药效学研究
• 5.1 材料、实验仪器及实验动物
• 5.1.1 材料
• 5.1.2 主要试剂
• 5.1.3 主要仪器
• 5.1.4 细胞株及试验动物
• 5.2 方法与结果
• 5.3 讨论
• 5.4 小结
• 参考文献
• 6 结论及今后的工作
• 6.1 结论
• 6.2 课题的创新点
• 6.3 今后的工作
• 致谢
• 作者在攻读博士学位期间发表的论文