药对麻黄—地龙抗哮喘药效物质基础与作用机制研究

论文摘要

为了研究药对麻黄-地龙抗哮喘药效物质基础与作用机制,首先对麻黄-地龙不同配比在体外模型上进行了活性考察。方法:观察麻黄、地龙3种用量配比（1:1,1:3,1:9）的水煎液对10μmol /L卡巴胆碱（carbachol,CCh）、10μmol/L组胺（histamine, His）引起离体气管平滑肌张力增加的松弛作用,以及对10μmol/L CCh引起的离体气管上皮短路电流增加的抑制作用。结论:麻黄、地龙药对具有对抗CCh和His引起离体气管平滑肌收缩的作用,并有对抗CCh引起气管上皮离子分泌的作用。1:3的配比组合是麻黄、地龙药对的较优组成。对药对单煎合用、合煎两种配伍方式进行了比较。方法:测定指纹图谱,并结合定量考察指标化学成分。结果:两种配伍方式所得提取液的色谱图匹配度较高,全图谱的相似度大于0.9,有22个共有峰,峰面积相似度<0.9;合煎有利于麻黄生物碱溶出,单煎有利于地龙氨基酸溶出。运用“整体法”对麻黄-地龙药对进行平喘活性研究,即将麻黄-地龙（质量比1:3）单煎合用的混合水提液作为一个整体,通过AB-8大孔吸附树脂划分成水、50%乙醇、95%乙醇三个洗脱部位,然后对三个极性部分进行平喘作用的考察。结果:三种极性部位均有对抗CCh和His引起的豚鼠气管平滑肌张力增加的作用,且水洗脱部位对抗CCh引起的大鼠气管上皮短路电流增加的作用较强,而含乙醇（50%乙醇和95%乙醇）洗脱部位均没有明显的作用。结论:药对中不同极性大小的物质可能通过不同的作用机制都有抗哮喘效果,但综合起来考虑,水洗脱高极性部位的平喘效果要优于其它部位。运用“组合法”对麻黄-地龙药对的平喘活性进行研究,即分别筛选出两个药材的有效部位,再进行组合部位的药效考察。首先优化了麻黄总生物碱的提取分离工艺,结果用酸水提取、乙酸乙酯萃取方法得到含量大于50%的麻黄总碱（M）。接着优化了地龙的提取分离工艺,将地龙水提醇沉后的提取液通过离子交换树脂划分成地龙酸性部位（S）、地龙碱性部位物（J）、地龙醇沉部分（D）,在解痉和抑制上皮离子分泌两种体外模型,筛选出地龙平喘有效部位为S。体内药效实验进一步显示S具有对抗乙酰胆碱和His混合液引起豚鼠平滑肌痉挛作用,并在氨水引咳的小鼠模型上具有镇咳作用。接着试图将S通过大孔吸附树脂进一步划分成高极性（S30）和低极性（S95）两个部位,并用两部位对卵蛋白诱发哮喘小鼠的抗炎和免疫调节作用进行考察,结果在降低支气管肺泡灌洗液（BALF）中EOS细胞数量方面,S优于S30和S95;在降低IGE,IL-4,IL-5,IL-13水平方面,S和S30、S95相比没有显著性差异。以上结果提示:划段分离后并不能得到活性比划分前更有效的部位。筛选出地龙的有效部位后,再对M与S、J、D分别组合的组合物,以及单用M或单用S的活性进行考察比较。体外实验结果表明对于CCh和His引起的豚鼠离体气管平滑肌收缩的舒张作用,以及CCh引起大鼠气管黏膜短路电流上升的抑制作用,MS的组合均优于MJ和MD组合。体内实验结果进一步显示MS组合对于乙酰胆碱和His混合液致豚鼠哮喘的平喘作用优于单用M;MS对于氨水引咳的小鼠镇咳作用优于单用S。以上研究结果表明麻黄与地龙组合优于单独使用一种,且两种药的最佳组合部位为MS,即麻黄总碱与地龙的酸性部位组合。可能的平喘作用机制为解痉、抑制上皮离子分泌以及镇咳作用。对于麻黄和地龙的有效部位中的化学成分进行了测定。利用酸性染料比色法测定了麻黄总碱中生物碱含量大于80%;用HPLC法测定了其中2个主要成分麻黄碱和伪麻黄碱的含量,在总碱中占80%。用茚三酮比色法测得地龙酸性部位总氨基酸含量在80%左右;利用HPLC、GC-MS、UPLC-MS等定性定量了该部位中的42个化学成分,包括氨基酸类（16个）,嘌呤嘧啶类（5个）,多羟基类（4个）,脂肪酸类（17个）。即在麻黄、地龙中的最佳有效组合物中共有44个化学成分得到了确认。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 前言
• 1.1 课题背景介绍
• 1.1.1 药对
• 1.1.2 麻黄的研究进展
• 1.1.3 地龙的研究进展
• 1.1.4 麻黄-地龙药对的研究进展
• 1.1.5 哮喘的研究进展
• 1.2 本课题研究的意义以及研究内容
• 1.2.1 经济建设和社会发展需求
• 1.2.2 课题研究的主要内容
• 参考文献
• 第二章 麻黄-地龙药对用量配比及平喘作用机制的研究
• 2.1 引言
• 2.2 短路电流原理
• 2.2.1 Isc测定装置
• 2.2.2 工作原理
• 2.3 离子转运与离子通道
• 2.4 仪器与材料
• 2.5 方法
• 2.5.1 气管平滑肌张力测定
• 2.5.2 上皮跨膜电压、电阻和短路电流测定
• 2.5.3 统计分析
• 2.6 结果
• 2.6.1 三种配比水提物对卡巴胆碱和组胺引起气管张力增加的松弛作用
• 2.6.2 三种配比水提物对卡巴胆碱引起气管上皮短路电流上升的抑制作用
• 2.7 小结与讨论
• 参考文献
• 第三章 麻黄-地龙药对配伍方式考察
• 3.1 引言
• 3.2 仪器与实验材料
• 3.3 HPLC法测定麻黄－地龙单煎合用与合煎溶液中麻黄生物碱的含量
• 3.3.1 HPLC色谱条件
• 3.3.2 标准曲线的绘制
• 3.3.3 精密度试验
• 3.3.4 加样回收率试验
• 3.3.5 HPLC法测定黄碱、伪麻黄碱含量
• 3.4 酸性染料比色法测定麻黄－地龙单煎合用与合煎溶液麻黄总生物碱含量
• 3.4.1 波长的选择
• 3.4.2 标准曲线的绘制
• 3.4.3 精密度试验
• 3.4.4 稳定性试验
• 3.4.5 回收率试验
• 3.4.6 样品含量的测定
• 3.5 茚三酮比色法测定麻黄－地龙单煎合用与合煎溶液中总氨基酸的含量
• 3.5.1 最大吸收波长的选择
• 3.5.2 线性关系的考察
• 3.5.3 精密度试验
• 3.5.4 稳定性试验
• 3.5.5 重复性实验
• 3.5.6 加样回收率试验
• 3.5.7 样品测定
• 3.6 比较麻黄地龙合煎液和单煎合用混合液的HPLC图谱
• 3.7 讨论
• 参考文献
• 第四章 麻黄-地龙单煎合用水提液不同极性部位平喘作用的研究
• 4.1 引言
• 4.2 仪器与实验材料
• 4.3 方法
• 4.3.1 气管平滑肌张力测定
• 4.3.2 上皮跨膜电压、电阻和短路电流测定
• 4.3.3 统计分析
• 4.4 结果
• 4.4.1 三种极性部位对CCh和His引起豚鼠气管张力增加的松弛作用
• 4.4.2 三种提取物对气管上皮短路电流的影响
• 4.5 结论
• 4.6 讨论
• 参考文献
• 第五章 麻黄与地龙不同部位组合的平喘作用研究
• 5.1 引言
• 5.2 仪器与实验材料
• 5.3 麻黄的提取分离研究
• 5.3 1 树脂法考察麻黄总生物碱提取分离工艺
• 5.3.2 溶剂法考察麻黄总生物碱提取分离工艺
• 5.3.3 结果
• 5.3.4 结论与讨论
• 5.4 地龙的提取分离研究
• 5.4.1 离子交换树脂分离的原理及应用
• 5.4.2 单因素考察地龙酸性部位提取工艺
• 5.4.3 阴离子树脂分离地龙酸性部位工艺考察
• 5.5 地龙平喘有效部位的筛选及部位组合物平喘作用考察
• 5.5.1 方法
• 5.5.2 结果
• 5.5.3 结论
• 5.5.4 讨论
• 参考文献
• 第六章 地龙抗哮喘有效部位化学成分分析
• 6.1 引言
• 6.2 仪器和实验材料
• 6.3 HPLC分析地龙酸性部位中次黄嘌呤的含量
• 6.3.1 HPLC 色谱条件
• 6.3.2 分析方法考察
• 6.3.3 样品测定及结果
• 6.3.4 讨论
• 6.4 氯甲酸乙酯衍生GC-MS法对地龙酸性部位的分析
• 6.4.1 衍生方法
• 6.4.2 GC/MS分析条件
• 6.4.3 地龙酸性部位中化学成分的定性分析
• 6.4.4 GC-MS方法学考察
• 6.4.5 样品测定及结果
• 6.4.6 讨论
• 6.5 三甲基硅烷衍生GC－MS法对地龙酸性部位的分析
• 6.5.1 衍生方法
• 6.5.2 气相色谱质谱条件
• 6.5.3 实验结果
• 6.5.4 结论与讨论
• 6.6 UPLC－MS测定地龙酸性部位中脂肪酸的含量
• 6.6.1 质谱条件的优化
• 6.6.2 色谱条件的优化
• 6.6.3 地龙酸性部位中脂肪酸化学成分的确认
• 6.6.4 分析方法考察
• 6.6.5 样品含量测定
• 6.6.6 结论与讨论
• 参考文献
• 第七章 研究总结与展望
• 7.1 研究工作总结
• 7.1.1 利用药效学指标考察药对麻黄、地龙用量配比及可能的平喘作用机制.
• 7.1.2 利用化学分析指标比较了麻黄与地龙单煎合用、合煎的提取工艺
• 7.1.3 整体法:考察麻黄-地龙单煎合用水提液不同极性部分
• 7.1.4 组合法:考察麻黄生物碱部位与地龙各个部位的组合物
• 7.1.5 地龙酸性部位化学成分定性定量分析
• 7.2 全文结论
• 7.3 论文创新点
• 7.4 展望
• 攻读博士学位期间主要研究成果
• 缩略名词
• 致谢
• 上海交通大学学位论文答辩决议书