葡萄（Vitis vinifera）类病毒检测

论文摘要

类病毒是一类单链闭合环状RNA分子,具有自我复制能力,但不编码蛋白,大小为239-475nt,是迄今为止发现的最小病原物。葡萄是我国一种重要的经济作物,现已经证明它可以被5种类病毒侵染:葡萄黄痘类病毒-1（Grapevine yellow speckle viroid-1,简称GYSVd-1）,葡萄黄痘类病毒-2（Grapevine yellow speckle viroid-2,简称GYSVd-2）,澳大利亚葡萄类病毒（Australia grapevine viroid,简称AGVd）,啤酒花矮化类病毒（Hop stunt viroid,简称HSVd） ,柑橘裂皮类病毒（Citrus exocortis viroid,简称CEVd）。对葡萄而言只有被GYSVd-1和GYSVd-2侵染时有明显症状,其它三种类病毒在葡萄中均表现为潜伏侵染,其中HSVd和CEVd侵染其他经济作物则会引起病害,严重影响果实的外观及商品价值。它可以通过修剪、嫁接等农事操作进行广泛传播。一旦感染类病毒后,最有效的控制方法就是将被感染的植株连根拔除,但这样将会严重影响其经济效益,因此,对于葡萄进行类病毒检测具有重要意义。本文旨在以葡萄为材料进行分子检测实验,为建立并完善葡萄类病毒的检测体系提供参考;通过对AGVd这种很罕见的类病毒进行序列分析比较,了解类病毒在不同地域、寄主间的变异情况,为今后研究类病毒致病机理以及与寄主的共进化关系奠定基础。本实验制备了三种葡萄类病毒（GYSVd,HSVd,AGVd）的RNA探针及DNA探针,通过斑点杂交证明RNA探针比DNA探针灵敏1000倍左右。对采自北京、新疆的65个葡萄样品进行类病毒的检测,从以上样品中提取低分子RNA后,通过斑点杂交等方法检测。结果表明:38个样品中检测到GYSVd,其中北京35个样品,新疆3个样品,发病率达58.46%;4个样品中检测到AGVd,其中北京2个样品,新疆2个样品,发病率达6.15%;50个样品中检测到HSVd,其中北京43个,新疆7个,发病率达76.90%。参照GenBank上发表的GYSVd、AGVd、HSVd、CEVd序列设计引物,筛选用于检测AGVd、HSVd的特异性引物;设计可以区分GYSVd-1和GYSVd-2的特异性引物;同时设计两对用于检测CEVd的特异性引物但均未得到阳性信号。对斑点杂交阳性样品井川-1014和早玉进行AGVd的克隆、测序分析,并与GenBank中已发表的AGVd序列进行比较,结果表明:从北京葡萄样品上分离到的AGVd的序列与之前从中国新疆吐鲁番葡萄样品无核白上分离到的AGVd的同源性最高。唯一区别在于本实验得到的所有克隆的第15位碱基都有替换的现象。本实验建立了Northern杂交用于检测类病毒的实验程序。用于检测GYSVd和HSVd时,0.75g样品足以达到检测目的;用于检测AGVd时,3g样品会有信号产生。生物学检测的结果表明HSVd和AGVd同时侵染指示植物黄瓜（Cucumis sativus L. cv. Suyo）时,只检测到HSVd,可能是AGVd在指示植物内会受到HSVd的抑制。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 类病毒
• 1.2 葡萄类病毒
• 1.2.1 葡萄黄痘类病毒
• 1.2.2 澳大利亚葡萄类病毒
• 1.2.3 啤酒花矮化类病毒
• 1.2.4 柑橘裂皮类病毒
• 1.2.5 葡萄类病毒的传播
• 1.2.6 葡萄类病毒侵染性的研究
• 1.3 类病毒的检测方法
• 1.3.1 生物学检测
• 1.3.2 聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 1.3.3 分子杂交技术
• 1.3.4 聚合酶链式反应
• 1.4 本研究的目的及意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料与仪器
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 引物设计
• 2.1.3 试剂
• 2.1.4 指示植物
• 2.1.5 仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 样品处理
• 2.2.2 低分子RNA 的提取
• 2.2.3 生物学检测
• 2.2.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 2.2.5 核酸杂交
• 2.2.6 RT-PCR
• 2.2.7 PCR 产物克隆
• 3 结果与分析
• 3.1 葡萄黄痘类病毒的检测
• 3.1.1 RNA 探针和DNA 探针检测灵敏度的比较
• 3.1.2 组织印迹杂交
• 3.1.3 斑点杂交
• 3.1.4 RNA 探针的再利用及其检测的灵敏度分析
• 3.1.5 Northern 印迹杂交
• 3.1.6 RT-PCR 扩增
• 3.2 澳大利亚葡萄类病毒的检测与序列分析
• 3.2.1 斑点杂交
• 3.2.2 RT-PCR
• 3.2.3 AGVd 的克隆
• 3.2.4 Northern 印迹杂交
• 3.2.5 生物学检测
• 3.2.6 筛选RT-PCR 引物
• 3.3 啤酒花矮化类病毒的检测
• 3.3.1 组织印迹杂交
• 3.3.2 斑点杂交
• 3.3.3 RNA 探针用于检测HSVd 的效率
• 3.3.4 Northern 印迹杂交
• 3.3.5 RT-PCR 引物的筛选
• 3.3.6 生物学检测
• 3.4 柑橘裂皮类病毒的检测
• 4 讨论
• 4.1 葡萄黄痘类病毒的检测
• 4.2 澳大利亚葡萄类病毒的检测及序列分析
• 4.3 啤酒花矮化类病毒的检测
• 4.4 柑橘裂皮类病毒的检测
• 5 结论
• 5.1 类病毒的检测
• 5.2 AGVd 的序列分析
• 致谢
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文