拟南芥类动蛋白AtKP1的亚细胞定位研究

论文题目: 拟南芥类动蛋白AtKP1的亚细胞定位研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 生物化学与分子生物学

作者: 倪成志

导师: 刘国琴

关键词: 类动蛋白,亲和纯化抗体,分布与功能,线粒体

文献来源: 中国农业大学

发表年度: 2005

论文摘要: 动蛋白(kinesin)是由Vale等于1985年在研究枪乌贼巨大神经轴突中囊泡的快速定向运输时首先发现并命名的一类微管马达蛋白。动蛋白利用其水解ATP所产生的能量沿着微管进行定向运动,同时完成其在细胞内众多的生物学过程,包括囊泡和细胞器的运输、有丝分裂和减数分裂的进行、染色体的分离以及微管动力学的调控等。 最近,本实验室王海庆博士从拟南芥中克隆到一个新的类动蛋白基因AtKP1(GenBank序列登录号为AF398149),并对其马达区的基本生化特性进行了研究,同时以AtKP1的特异多肽(886-1086aa)为抗原制备了抗血清。 为了对AtKP1进行亚细胞定位,本研究首先通过离子交换层析和亲和层析对AtKP1抗体进行了纯化,并鉴定了该抗体的特异性。分别用AtKP1预血清、抗血清以及亲和纯化的AtKP1抗体对拟南芥根的蛋白抽提液进行了免疫印迹分析。结果表明,亲和纯化的AtKP1抗体标记出预血清未能识别的、分子量约为125KD的1条印迹。为确证此蛋白是AtKP1,我们进一步用His-tag抗体、抗动物动蛋白的单克隆抗体和亲和纯化的AtKP1抗体分别对含有原核表达的AtKP1抗原和AtKP1全长多肽的菌裂解液进行标记。结果证明,亲和纯化的AtKP1抗体所识别的蛋白为类动蛋白AtKP1。 利用免疫印迹和免疫荧光方法对AtKP1在拟南芥中的组织特异性分布进行了研究。进行免疫印迹时,我们以β-actin的含量为参照,确定电泳时各组织蛋白抽提液的上样量一致。免疫印迹结果表明,AtKP1在花器官中分布最多,然后依次为茎、叶、根,而在果荚中没有发现AtKP1。免疫荧光标记结果表明,类动蛋白AtKP1在拟南芥主根分生区、侧根以及叶中均有分布。 我们用AtKP1抗体和微管抗体对拟南芥根尖单细胞进行了免疫荧光双标记。结果发现,在细胞分裂间期,AtKP1主要分布在细胞质中。从细胞有丝分裂期的早前期、经纺锤体时期,直至成膜体时期,AtKP1并未与通过微管蛋白显示的有丝分裂装置共定位,而是以颗粒状形式分布在细胞质中。据此我们推测类动蛋白AtKP1可能结合于细胞器或囊泡。 为确定AtKP1存在于哪种细胞器上,我们利用蔗糖密度梯度超离心从拟南芥叶片中分离出线粒体、微体、细胞质以及叶绿体,并利用AtKP1抗体对其进行了免疫印迹分析。结果表明,AtKP1特异定位于线粒体,而在其它亚细胞组分中没有发现,同时高盐溶液无法将其从线粒体上释放下来,说明类动蛋白AtKP1紧密结合于线粒体。 总之,本研究结果表明:与目前已发现的大多数植物类动蛋白不同,AtKP1不参与细胞有丝分裂,而是紧密地结合于拟南芥线粒体,其功能可能与线粒体的活动有关。

论文目录:

1 文献综述—动蛋白研究进展

1.1 动蛋白的发现

1.2 动蛋白的结构

1.3 动蛋白生化特性

1.4 动蛋白的分类

1.5 动蛋白的活性调节

1.6 动蛋白的功能

1.7 高等植物中的类动蛋白

1.8 本研究的目的和意义

2 材料与方法

2.1 材料与试剂

2.1.1 实验材料

2.1.2 主要试剂

2.2 实验方法

2.2.1 植物材料的培养

2.2.2 类动蛋白AtKP1抗体的纯化

2.2.3 免疫印迹分析AtKP1在拟南芥中组织特异性分布

2.2.4 类动蛋白AtKP1在拟南芥根、叶中的免疫荧光标记

2.2.5 类动蛋白AtKP1和微管在拟南芥根单细胞中的免疫荧光双标记

2.2.6 细胞器的分离与类动蛋白AtKP1的免疫印迹分析

3 结果与分析

3.1 类动蛋白AtKP1抗体的纯化

3.2 类动蛋白AtKP1在拟南芥中组织水平的分布

3.3 类动蛋白AtKP1在拟南芥根单细胞有丝分裂过程中的免疫荧光定位

3.4 细胞器的分离与类动蛋白AtKP1的免疫印迹分析

4 讨论

总结

参考文献

致谢

发布时间: 2005-06-13

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