论文摘要
肝细胞癌（Hepatocelluar carcinoma, HCC）有着恶性程度高,易转移复发,难诊断,难治愈的特点。全球每年约有近60万人死于肝癌,并且有着日渐增加的趋势。我国是原发性肝癌高发的地区之一,肝癌发病率已占肿瘤总发病率第三位,死亡率更是高居第二位。尽管过去的三十多年,肝癌诊断治疗技术有了很大的进展,但并未从根本上改变肝癌发病率高死亡率高的状况。制约肝癌临床预后疗效的根本要素正是肝癌高转移高复发的特性。肿瘤的侵袭转移与肿瘤细胞所处的肿瘤微环境有着密切的关系。肿瘤微环境有着炎症、缺血与缺营养的特点。既往的研究都把这些“恶劣”的因素看成是静态,而没有从发展的角度上再观察炎症、缺血与缺营养在肿瘤微环境中的动态变化。事实上这些恶劣因素是以一种动态变化且循环平衡的方式贯彻于肿瘤的发生发展过程中。研究表明,肿瘤微环境可以促使肿瘤细胞发生上皮间质转化（Epithelial-mesenchymal-transition, EMT）而造成肿瘤的侵袭转移。既往的研究已经证实,炎症因子与动态变化的缺血缺氧都可以促使肿瘤细胞的EMT进程与维持其间质化特征。那么肿瘤微环境中动态变化的缺血缺营养可能对肿瘤细胞的EMT进程有着重要的影响。同时,这些因素也对肿瘤细胞发生与维持自噬有重要的作用。这正提示,肿瘤微环境中动态变化的缺血缺营养对肿瘤细胞的自噬状态与间质化特征有着重要的作用,并且这两者之间亦可能存在相互作用影响的关系。在本课题研究中,我们模拟肿瘤细胞所处的动态变化缺血缺营养肿瘤微环境特点,采用对人正常肝脏细胞与人肝癌细胞进行缺营养处理后恢复到正常营养培养的处理方法（S-R处理）,然后从以下三部分对肝癌细胞的自噬状态与间质化特征之间的关系进行探讨。第一部分：缺营养处理对细胞侵袭迁移能力的影响我们在体外模拟肿瘤细胞所处的动态变化缺血缺营养肿瘤微环境特点,采用对人正常肝脏细胞与人肝癌细胞进行缺营养处理后恢复到正常营养培养的处理方法（S-R处理）,可以发现这种处理方法可以使得肝癌细胞MHCC-97L与SMMC-7721的侵袭迁移能力显著增强,而对正常肝脏细胞不产生作用。并且增强的侵袭迁移能力归因于经S-R处理的肝癌细胞发生EMT使之具有间质细胞的迁移特征。同时这种效应在裸鼠皮下种植瘤模型中也得到进一步的验证。第二部分：抑制自噬对肝癌细胞间质化状态的影响我们发现经S-R处理的肝癌细胞SMMC-7721仍然维持一种持续激活的自噬状态,但维持这种持续激活自噬状态的因素并不是营养缺乏。进一步引入自噬抑制剂3-MA与CQ以阻断细胞自噬的维持,发现抑制自噬可以显著抑制SMMC-7721经S-R处理所获得的增强的侵袭迁移能力。结果提示,经S-R处理的SMMC-7721所获得的增强的迁移能力与侵袭表型是由持续激活的自噬状态所维持的。另外,在体内实验中注射CQ可以抑制S-R处理组持续激活的自噬状态,从而进一步抑制SMMC-7721细胞种植瘤的间质化状态的形成,降低其侵袭与转移潜能。第三部分：自噬增强肝癌细胞侵袭转移能力的机制研究我们发现经S-R处理的SMMC-7721细胞有显著上调的TGF-β1自分泌水平。而这正是维持其持续激活自噬状态与间质化特征的重要因素。抑制TGF-β1的作用可以有效破坏经S-R处理后SMMC-7721细胞的持续激活自噬状态,并且同时抑制SMMC-7721间质化状态的维持。另外,研究还提示,经S-R处理而上调的TGF-β1自分泌水平受SMMC-7721细胞自身持续激活的自噬状态所调节。综上所述,我们的研究结果提示以下结论：1.模拟肿瘤细胞所处的动态变化缺血缺营养肿瘤微环境特点的S-R处理可以特异地使肝癌细胞处于持续激活的自噬状态。2.持续激活的自噬状态使得肝癌细胞的TGF-β1自分泌水平显著上调,同时这上调的TGF-β1自分泌水平进一步维持肝癌细胞持续激活的自噬状态,从而形成正反馈的循环效应。3.TGF-β1是诱导EMT发生与维持间质化特征的重要因素,从而使得经S-R处理的肝癌细胞获得侵袭表型与增强的转移潜能,从而对这对肝癌细胞在初期浸润侵袭与远期形成转移灶有着重要作用。
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