粗毛栓菌的木质纤维素降解酶及其基因克隆

论文题目: 粗毛栓菌的木质纤维素降解酶及其基因克隆

论文类型: 博士论文

论文专业: 遗传学

作者: 孙迅

导师: 张义正

关键词: 粗毛栓菌,木质纤维素降解酶,发酵条件,微阵列,克隆,锰过氧化物酶,热激蛋白

文献来源: 四川大学

发表年度: 2005

论文摘要: 木质纤维素主要由纤维素、半纤维素和木质素组成,是自然界中广泛存在的可再生的数量巨大的生物质资源。微生物来源的纤维素酶和半纤维素酶可分别水解纤维素和半纤维素。由于木质素结构高度复杂,从而使植物生物质的利用受到很大限制。白腐真菌所产生的木质素降解酶可有效地分解木质素和芳香族污染物,因而在生物制浆、纸浆的生物漂白和环境保护等方面具有重要的研究价值和应用前景。黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)作为木质素生物降解模式种,一直是被广泛研究的对象,但它的木质素降解酶活性并不令人满意,如,它几乎不产生漆酶,而漆酶却是木质素酶系的重要成员。因此,选育高产木质素降解酶菌株、克隆和高效表达木质素降解酶cDNA是研究木质素降解的主要研究内容。粗毛栓菌(Trametes gallica)是一种白腐担子菌,在我国分布广泛,是杨木的一种主要生物降解者。已有研究表明,该菌具有较强的降解木质纤维素的能力。本论文以T.gallica作为出发菌,在以下4个方面进行了研究工作:(1)研究了其产生木质纤维素降解酶的条件;(2)对其部分木质素降解酶进行了分离纯化和性质分析;(3)利用基因芯片技术将其与模式菌株的差异表达基因做了比较和分析;(4)克隆了锰过氧化物酶cDNA和热激蛋白cDNA。取得如下研究结果: 第一,采用不同发酵条件,研究了粗毛栓菌产过氧化物酶和漆酶的特点。结果表明,高碳低氮(2.2mmol/L)-浅层液体静置培养有利于粗毛栓菌产生锰过氧化物酶。例如,以葡萄糖作碳源,培养12d时的MnP活力达到36.9U/L。相反,漆酶产量在低碳高氮-振荡培养条件下是最高的。无论是高氮还是低氮营养,浅层静置培养的T.gallica都仅能产少量的漆酶。在以苯丙氨酸作氮源的

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第一章 粗毛栓菌产木质纤维素降解酶发酵条件的研究

摘要

1 引言

2 材料与方法

2．1 菌株

2．2 主要仪器和试剂

2．3 培养基

2．4 菌株培养方式和产酶实验类型

2．5 木质纤维素降解酶活力的测定

2．6 酶谱分析方法

3 结果

3．1 振荡和静置培养对T． gallica产锰过氧化物酶和漆酶的影响

3．2 不同氮源对粗毛栓菌产木质纤维素降解酶的影响

3．3 固态发酵条件对粗毛栓菌产木质纤维素降解酶的影响

3．4 粗毛栓菌木聚糖酶、纤维素酶和漆酶的酶谱分析

4 讨论

4．1 培养方式对粗毛栓菌产木质纤维素降解酶的影响

4．2 粗毛栓菌在麦草固态培养物中产过氧化物酶的特点

4．3 粗毛栓菌木聚糖酶、纤维素酶和漆酶的酶谱分析技术

小结

参考文献

第二章 粗毛栓菌锰过氧化物酶和漆酶的纯化及部分性质研究

摘要

1 引言

2 材料与方法

2．1 主要仪器及试剂

2．2 菌株及培养方式

2．3 粗酶液的制备

2．4 层析方法

2．5 蛋白含量的测定

2．6 酶的电泳法制备

2．7 锰过氧化物酶和漆酶分子量的测定

2．8 锰过氧化物酶和漆酶等电点的测定

2．9 一种测定蛋白质等电点的新方法

3 结果

3．1 粗毛栓菌锰过氧化物酶和漆酶的柱层析纯化

3．2 MnP和漆酶的活性-PAGE法纯化

3．3 MnP和漆酶分子量的测定

3．4 MnP和漆酶的等电点

3．5 MnP和漆酶的部分性质分析

3．6 一种等电点测定新方法

4 讨论

4．1 粗毛栓菌木质纤维素降解酶的纯化

4．2 MnP和漆酶的鉴别

小结

参考文献

第三章 用基因芯片技术研究粗毛栓菌的差异表达基因

摘要

1 引言

2 材料与方法

2．1 主要仪器

2．2 菌株及培养方法

2．3 RNA的提取

2．4 RNA的电泳检测

2．5 荧光染料标记DNA的制备及杂交

2．6 成像和数据分析

2．7 DNA测序和序列同源性分析

3 结果

3．1 粗毛栓菌总RNA的分离与质量检测

3．2 cDNA微阵列杂交结果

3．3 杂交芯片上的基因列表

3．4 粗毛栓菌与黄抱原毛平革菌基因序列的同源性分析

3．5 差异表达基因的序列分析

4 讨论

4．1 T． gallica的差异表达基因

4．2 基因芯片技术的优缺点

小结

参考文献

第四章 粗毛栓菌锰过氧化物酶及热激蛋白cDNA的克隆和表达

摘要

1 引言

2 材料与方法

2．1 主要器材

2．2 分子克隆工具酶及生化试剂

2．3 菌株和质粒

2．4 培养基

2．5 E．coli质粒DNA的提取

2．6 引物设计

2．7 逆转录和总cDNA的 PCR扩增

2．8 PCR反应

2．9 PCR产物的纯化

2．10 限制性内切酶反应和DNA连接反应

2．11 大肠杆菌的转化

2．12 酵母菌转化

2．13 重组子的鉴定

2．14 DNA序列测定和分析

2．15 表型重组酵母的诱导表达

3 结果

3．1 T． gallica总cDNA的合成

3．2 T． gallica锰过氧化物酶cDNA的克隆与鉴定

3．3 T． gallica热激蛋白cDNA的克隆与鉴定

3．4 热激蛋白cDNA在毕赤酵母中的表达

4 讨论

4．1 T． gallica锰过氧化物酶cDNA片段的密码子偏爱性分析

4．2 T． gallica锰过氧化物酶cDNA序列的同源性分析

4．3 T． gallica热激蛋白cDNA的密码子偏爱性分析

4．4 T． gallica热激蛋白cDNA的同源性分析

小结

参考文献

文献综述 锰过氧化物酶基因表达调控研究进展

摘要

1 引言

2 锰过氧化物酶的来源

3 锰过氧化物酶及其基因的生物化学

3．1 锰过氧化物酶的化学组成和结构

3．2 锰过氧化物酶的催化反应

3．3 锰过氧化物酶基因的结构特点

4 锰过氧化物酶基因的表达调控

4．1 锰过氧化物酶基因表达研究概况

4．2 表达调控

5 锰过氧化物酶的应用

5．1 生物制浆

5．2 环境保护方面的应用

6 展望

参考文献

致谢

在读期间的研究成果

声明

发布时间: 2005-10-08

参考文献

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• [4].木质纤维素降解真菌斜卧青霉的比较基因组学与功能基因组学研究[D]. 刘国栋.山东大学2012
• [5].解析内生细菌Pantoea ananatis Sd-1的木质纤维素降解体系研究[D]. 马江山.湖南大学2016
• [6].草酸青霉木质纤维素降解酶系的解析及主要相关蛋白组分的功能研究[D]. 宋文霞.山东大学2016
• [7].草酸青霉纤维素降解酶系主要转录调控因子研究及菌株改良[D]. 张艳美.山东大学2014

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