论文摘要
DNA-PKcs是DNA依赖蛋白激酶的催化亚单位（DNA Dependent Protein Kinase Catalytic Subunit）,与另外两个亚单位Ku70和Ku80共同构成DNA-PK复合物。与ATM、ATR等同属于磷脂酰肌醇3-激酶相关蛋白激酶（Phosphatidyl inositol-3-kinase-like kinase, PIKK）超家族成员。最初确定的DNA-PKcs的功能是参与DNA双链断裂的非同源末端连接（NHEJ）和V（D）J重组,后来又发现其在维持染色体端粒末端结构稳定性中发挥重要的作用。研究显示DNA-PKcs以其丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶活性可磷酸化多种重要的功能蛋白底物,包括有多种癌基因产物和转录因子,如Artimes、Akt、H2AX、c-fos、c-myc、oct-1、c-jun等,表明DNA-PKcs是一种具有多种功能的蛋白。近年来有越来越多的实验研究报道,DNA-PKcs在肿瘤组织中异常高表达。本实验室的前期研究发现,在辐射诱发的部分癌变细胞中DNA-PKcs表达和激酶活性均显著提高;通过免疫组化分析显示约90%的肝癌患者的癌组织中DNA-PKcs表达呈强阳性,而对照的正常肝组织中所检测到的DNA-PKcs水平明显要低;发现DNA-PKcs通过Akt/GSK3β/c-Myc的信号调节通路调节c-Myc蛋白稳定性,提示DNA-PKcs很可能参与细胞恶性化过程。此外,某些组织来源细胞的不同发育阶段DNA-PKcs的表达水平也不同,生殖细胞减数分裂前DNA-PKcs表达明显高于减数分裂后,而一些没有增殖能力的细胞根本不表达DNA-PKcs或DNA-PKcs表达水平非常低,提示DNA-PKcs参与细胞增殖过程。最近有实验研究报道,DNA-PKcs参与DNA损伤后G2/M期监测点调节过程。而且有报道,DNA-PKcs等DNA损伤蛋白定位于中心体结构,种种证据显示,DNA-PKcs可能通过细胞周期调节细胞增殖生长。本论文利用DNA-PKcs表达抑制细胞模型等,通过电离辐射等诱发DNA损伤,研究DNA-PKcs对细胞有丝分裂过程中纺锤体、中心体等重要亚细胞结构和功能的调节作用,观察DNA-PKcs功能缺失后DNA损伤细胞周期监测点功能变化和细胞死亡机制,取得了如下主要进展:（1）用4Gyγ射线照射或拓扑异构酶IIα抑制剂doxorubicin作用后, DNA-PKcs沉默的HeLa-H1细胞G2-M期阻滞时间显著延长、出现高比例的多倍体和大量多核细胞（30%～40%）,有丝分裂中期细胞多中心体或多极纺锤体细胞比率也明显高于对照细胞。共聚焦显微镜实时监测技术观察到照后24h-48h DNA-PKcs沉默细胞中出现胞质分裂失败、有丝分裂期时间延长、核分裂无法完成等现象,导致有丝分裂灾变最终凋亡,说明DNA-PKcs对DNA损伤细胞有丝分裂发挥重要的调控作用;进一步利用RNA干扰技术在HepG2细胞中稳定下调DNA-PKcs蛋白表达,同样观察到多核细胞增加、多极纺锤体和有丝分裂灾变死亡等现象。（2）首次确定了对于DNA-PKcs发挥功能至关重要的磷酸化形式（pT2609）在细胞周期不同时期的亚细胞定位。发现DNA-PKcs pT2609在有丝分裂期细胞中的定位随有丝分裂进程的变化而改变,先特异定位于着丝粒和中心体、随后定位在纺锤体中心,胞质分裂期末期聚集在中体,而DNA-PKcs pT2647在细胞有丝分裂期定位于中心体,没有观察到在着丝粒和中体的定位,表明DNA-PKcs不同的磷酸化形式具有不同的生物学功能。（3）发现DNA-PKcs pT2609在细胞有丝分裂期与Plk1在不同的亚细胞区域共定位,免疫共沉淀、GST-pull down发现两者存在体内体外相互作用,进一步提示两蛋白功能相关。同时发现DNA-PKcs沉默下调Plk1蛋白水平,但mRNA水平不受影响,表明DNA-PKcs可能通过调节Plk1蛋白稳定性参与对细胞有丝分裂调节过程;另外,DNA-PKcs沉默细胞中,照射后Chk2 T68磷酸化水平下降,并且DNA-PKcs与Chk2存在相互作用。正常细胞中Chk2 T68磷酸化水平随细胞周期变化而变化,在G2/M期达高峰,但在DNA-PKcs沉默的HeLa细胞中,这种周期性变化消失,提示在细胞周期及DNA损伤后细胞周期监测点调节过程中DNA-PKcs可能是Chk2上游分子。（4）本研究发现DNA-PKcs与p53诱导凋亡相关蛋白PIG3的相互作用,该复合体中还包含有转录抑制因子KAP-1,并在辐射诱发的DSBs损伤位点聚集。还观察到PIG3可与p53相互作用并抑制p53转录活性,提示PIG3可能参与DNA损伤后对p53转录活性的调节过程,而DNA-PKcs可能参与其中。（5）本研究还发现c-Myc蛋白的294-370区域与DNA-PKcs存在相互作用。c-Myc的294-370缺失体在HeLa细胞中的蛋白量（稳定性）显著高于全长c-Myc或其它截短体蛋白,提示该区域是c-Myc蛋白降解结构域。DNA-PKcs与294-370区域的结合,可能在物理结构上封闭了其它蛋白对该区域的作用,从而影响了c-Myc蛋白的稳定性。同时发现DNA-PKcs沉默细胞中,c-Myc蛋白下游蛋白p27蛋白水平升高,cyclinE蛋白水平降低,表明DNA-PKcs可能通过对c-Myc蛋白的调节,也间接参与细胞周期调节过程。本研究提供了多方面的有力证据,表明了DNA-PKcs对细胞有丝分裂进程及DNA损伤诱发细胞周期监测点机制的重要调控作用,揭示了DNA-PKcs的DNA修复功能以外的重要生物学作用。鉴于本研究发现,DNA-PKcs还将是一个抗肿瘤药物或技术措施研究的有效分子靶标。本研究还初步揭示了DNA-PKcs可能在p53转录活性的调节过程中发挥功能。
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