孤儿G蛋白偶联受体hGPCRc克隆、分析及配基筛选

论文摘要

G蛋白偶联受体（G protein-coupled receptors,GPCRs）是一大类通过G蛋白介导其生物效应的膜受体总称。GPCR是迄今最重要的新药研究靶点,据统计,以GPCR为靶点的新药数量约占药物市场的40%。通常,将核苷酸序列已知而配基和功能尚未确定的GPCRs称为孤儿GPCRs（orphan GPCRs,oGPCRs）,记为oGPCRs。对oGPCRs而言,寻找其内、外源性配基已成为oGPCRs研究的重点和难点,一旦突破,无论对于揭示其生理功能和病理意义,还是对于以此为靶点研发相关疾病新的防治药物均具有重大意义。 本研究根据已有文献资料和相关数据库提供的信息,成功克隆了一个人源oGPCR新成员,（GeneBank登录号为AB083598）,命名为hGPCRc。我们首先利用RT-PCR从人结肠组织获得hGPCRc的氨基酸编码cDNA序列,然后又以健康志愿者外周血细胞基因组DNA为模板进行PCR扩增,得到了同样大小的DNA序列,经测序比较两者为同一基因序列,表明该受体的基因没有内含子,符合多数GPCRs基因缺乏内含子的规律;运用生物信息学手段,利用NCBI网站提供的相关软件进行分析,结果表明,hGPCRc位于人染色体13q32.2,与小鼠、大鼠的对应物序列同源性高达85%,但与人源其他已知基因的同源性较低,对应的氨基酸序列组成了七个跨膜区段的结构域;进化树分析显示与已知人P2Y1同源性最高也仅为36%,显然,hGPCRc属于人类oGPCRs的新成员。 为了深化对hGPCRc的认识,我们以RT-PCR检测hGPCRc基因在人体部分组织器官的表达情况。结果表明,hGPCRc在胎儿较多组织均有表达,其中以肾脏、心脏和结肠等最高,推测hGPCRc很可能参与广泛的生理或病理过程,提示该受体可作为多种疾病防治靶点的潜在可能性。另外,用构建的GFP-hGPCRc融合表达载体转染CHO-K1细胞系,转染细胞继续培养一周后,在激光扫描共聚焦显微镜下观察,结果显示GFP-hGPCRc转染细胞的荧光清晰聚集于细胞膜上,证实hGPCRc蛋白位于细胞膜并稳定表达。 目前,最常用的配基筛选策略之一是基于oGPCRs表达工程细胞株第二信使的检测。为筛选hGPCRe的特异性配基,必需建立符合hGPCRc配基检测要求的体系,再从化合物库或人源组织提取物筛选其可能的配基。由于hGPCRc与P2Y1同源性的最高,因此推测其与Gq偶联的可能性最大,而Gq介导的效应为增加细胞内钙离子浓度,后者作为第二信使进一步完成相应的生理功能和生化反应过程。鉴于此,本

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• Ⅰ 文献综述
• 1 GPCRs简介
• 1.1 GPCRs的结构特点
• 1.2 GPCRs的分类及配基的活化
• 2 oGPCRs作为新药靶点的研究
• 2.1 oGPCRs的发现
• 2.2 配基的发现
• 2.2.1 同源比较法
• 2.2.2 非同源比较法
• 2.2.3 配基活化的检测
• 2.3 受体—配基对的生理功能及病理意义研究
• 3 成功“去孤儿化”举例
• 4 问题与展望
• Ⅱ 材料与方法
• 1 实验材料
• 1.1 标本来源
• 1.2 菌株及质粒
• 1.3 主要试剂
• 1.4 主要器材
• 2 实验方法
• 2.1 hGPCRc的克隆及测序
• 2.1.1 引物设计及合成
• 2.1.2 以RT-PCR从结肠组织扩增hGPCRc
• 2.1.3 PCR法从人血基因组扩增hGPCRc编码序列
• 2.1.4 扩增产物的纯化回收
• 2.1.5 hGPCRc的连接
• 2.1.6 感受态制备
• 2.1.7 转化
• 2.1.8 阳性克隆筛选、鉴定
• 2.1.9 测序
• 2.2 hGPCRc的生物信息学分析
• 2.2.1 hGPCRc蛋白质序列的跨膜分析
• 2.2.2 蛋白质序列的同源分析
• 2.2.3 蛋白质序列的进化树分析
• 2.2.4 hGPCRc基因的染色体定位分析
• 2.2.5 蛋白质结构功能分析
• 2.3 hGPCRc基因的组织表达分布
• 2.4 表达载体GFP-hGPCRc及pcDNA3.1（+）-hGPCRc的构建
• 2.5 阳性重组子筛选、鉴定
• 2.6 细胞培养
• 2.6.1 培养液的配制
• 2.6.2 Hepes工作液配制
• 1细胞的培养'>2.6.3 CHO-K₁细胞的培养
• 2.7 细胞转染
• 2.8 融合蛋白的细胞定位
• 2.9 阳性克隆细胞的筛选
• 2.10 RT-PCR扩增转染细胞内hGPCRc之mRNA的表达情况
• 2.11 激光扫描共聚焦显微镜测定CHO-hGPCRc细胞株内钙离子浓度
• Ⅲ 结果
• 1 hGPCRc编码基因的PCR扩增产物
• 2 目的片段hGPCRc和测序载体的连接与产物鉴定
• 3 hGPCRc基因扩增产物的序列测定
• 4 测序结果比较
• 5 hGPCRc的氨基酸结构域分析
• 6 hGPCRc氨基酸序列的同源分析
• 7 hGPCRc基因的进化树分析
• 8 hGPCRc基因的染色体定位
• 9 hGPCRc基因的组织表达分布
• 10 表达载体GFP-hGPCRc的构建和鉴定
• 11 表达载体pcDNA3.1（+）-hGPCRc的构建和鉴定
• 12 激光扫描共聚焦显微镜观察hGPCRc融合蛋白的细胞定位
• 13 CHO细胞系的转染及阳性克隆的筛选
• 14 CHO-hGPCRc细胞株稳定表达hGPCRc的鉴定
• 15 各化合物对胞内钙浓度的影响
• Ⅳ 讨论
• 1 GPCRs作为新药研究靶点的重要性及其配基筛选的方法
• 2 生物信息学在GPCRs中的应用
• 3 组织表达分布在配基筛选中的作用
• 4 亚细胞定位对研究GPCRs功能的重要性
• 5 配基筛选体系的建立及应用
• 6 GPCRs研究领域的探讨
• Ⅴ 结论
• 参考文献
• 缩略词表
• 致谢
• 附录