苏云金芽胞杆菌大质粒pBMB165的克隆与分析

论文摘要

本论文以苏云金芽胞杆菌为研究对象，克隆并绘制了质粒pBMB165的物理图谱，同时对苏云金芽胞杆菌BMB171 Enhancin蛋白基因的增效活性做了初步研究。本文第一部分，以苏云金芽胞杆菌拟步行甲亚种(Bacillus thuringiensis subsp．tenebrionis，H8ab)菌株YBT-1765为出发菌株，对其可检测到的最大质粒pBMB165进行克隆分析研究。通过对YBT-1765总质粒和全基因组DNA分别进行BamHI和HindⅢ不完全酶切，以pBeloBACll为载体，成功构建了苏云金芽胞杆菌YBT-1765的基因组的细菌人工染色体（BAC）文库和质粒的BAC文库。根据已克隆的包含复制子oril65在内的3.6kb片段（pBMB165-F4A）中编码复制蛋白Rep165的核苷酸序列设计探针，通过染色体步移方式进行筛选。在对质粒文库进行筛选时，得到5个具有重叠关系的克隆子，测定这些克隆子的末端序列。根据这些末端序列设计引物，通过染色体步移方式，对YBT-1765的基因组BAC文库进行筛选，获得8个覆盖质粒pBMB165不同区域的克隆子。测定这8个阳性克隆子的末端序列，序列结果显示它们之间存在着重叠群，并且能够覆盖整个质粒pBMB165。通过对上述13个克隆子进行NotI、SphI、HindⅢ和BamHI酶切分析，建立了质粒pBMB165的物理图谱和线状重叠连锁图，并测算出该质粒的大小为82kb。对其中一个阳性克隆pBMB165A2作了序列测定；根据部分核苷酸序列初步统计了pBMB165上转座因子的存在机率，在pBMB165A2上转座因子存在的机率值为40.5％，说明pBMB165中存在丰富的转座因子，YBT-1765菌株基因组文库的构建和物理图谱的绘制为克隆苏云金芽胞杆菌大质粒提供了一套可行的方案，成功解决了大质粒难克隆的问题。本文第二部分，以苏云金芽胞杆菌无晶体突变株BMB171为研究对象，对苏云金芽胞杆菌的Enhancin蛋白的增效活性做了初步研究，从而进一步认识Enhancin蛋白在促进Bt感染昆虫中的作用。根据已知的Enhancin蛋白基因序列设计特异引物，以BMB171菌株的基因组DNA为模板，能扩增出对应的预期目的片段Enhancin蛋白基因。经测序分析其预计蛋白质由742个氨基酸组成，其氨基酸序列与已经发现的昆虫病毒的增效蛋白有20％左右的序列一致，与鼠疫杆菌的增效蛋白同源性在31％以上。利用同源重组敲除BMB171菌株中的Enhancin蛋白基因，构建了突变株BMB1084。将表达杀虫晶体蛋白基因crylAc10的重组质粒pBMB1086导入菌株BMB171和突变株BMB1084，分别构建重组菌BMB1087和BMB1088。用上述重组菌的胞晶混合物分别感染棉铃虫一龄幼虫，重组菌BMB1087的LD50为0.46 mL／mL，比BMB1088 （2.73mL／mL）降低了82.85％，增效倍数为5.83，表明Enhancin蛋白显著提高了Bt对棉铃虫幼虫的毒力。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语表
• 1 苏云金芽胞杆菌大质粒pBMB165的克隆与分析
• 1.1 前言
• 1.1.1 细菌质粒的基本特征
• 1.1.1.1 质粒的类型
• 1.1.1.2 质粒的复制
• 1.1.1.3 质粒拷贝数
• 1.1.1.4 质粒的不相容性
• 1.1.1.5 质粒分离的稳定性
• 1.1.2 苏云金芽胞杆菌质粒的研究进展
• 1.1.2.1 苏云金芽胞杆菌质粒的分类
• 1.1.2.2 苏云金芽胞杆菌质粒多态性
• 1.1.2.3 苏云金芽胞杆菌质粒的功能
• 1.1.2.4 YBT-1765菌株质粒的研究进展
• 1.1.3 本研究的目的和意义
• 1.2 材料与方法
• 1.2.1 实验材料
• 1.2.1.1 菌株和质粒
• 1.2.1.2 培养基及培养条件
• 1.2.1.3 试剂和仪器
• 1.2.2 实验方法
• 1.2.2.1 DNA操作
• 1.2.2.2 DNA电泳分析
• 1.2.2.3 重组质粒的转化及转化子的筛选鉴定
• 1.2.2.4 BAC文库的构建
• 1.2.2.5 PCR扩增
• 1.2.2.6 酶切片段大小的估算
• 1.2.2.7 序列测定和序列分析
• 1.3 结果与分析
• 1.3.1 菌株YBT-1765 BAC文库的构建
• 1.3.2 菌株YBT-1765 BAC文库的筛选和分析
• 1.3.2.1 YBT-1765质粒的BAC文库的筛选与分析
• 1.3.2.2 YBT-1765基因组的BAC文库筛选与分析
• 1.3.3 质粒pBMB165的拼接
• 1.3.3.1 质粒pBMB165的部分限制性酶切图谱
• 1.3.3.2 质粒pBMB165的线状重叠连锁图
• 1.3.4 转座因子存在的大致机率
• 1.4 讨论
• 2 苏云金芽胞杆菌Enhancin蛋白的初步研究
• 2.1 前言
• 2.1.1 昆虫杆状病毒增效蛋白
• 2.1.1.1 昆虫杆状病毒增效蛋白的发现及其增效活性
• 2.1.1.2 增效蛋白的作用机理
• 2.1.1.3 增效蛋白核苷酸和氨基酸序列分析
• 2.1.2 Bt中的增效蛋白类似基因
• 2.1.3 增效蛋白在害虫防治上应用的展望
• 2.1.4 本研究的目的和意义
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 实验材料
• 2.2.1.1 菌株和质粒
• 2.2.1.2 培养基及培养条件
• 2.2.1.3 试剂和仪器
• 2.2.1.4 供试昆虫
• 2.2.1.5 生物测定试剂和感染饲料配方
• 2.2.2 实验方法
• 2.2.2.1 DNA操作，DNA电泳分析，重组质粒的转化及转化子的筛选鉴定
• 2.2.2.2 聚合酶链式反应
• 2.2.2.3 同源重组
• 2.2.2.4 复红简单染色
• 2.2.2.5 伴胞晶体的培养
• 2.2.2.6 SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳
• 2.2.2.7 生物测定
• 600值对应曲线'>2.2.2.8 菌体生长时间与菌体OD₆₀₀值对应曲线
• 2.3 结果和分析
• 2.3.1 Enhancin蛋白基因的克隆及序列分析
• 2.3.2 BMB171突变体的构建
• 2.3.2.1 整合载体的构建
• 2.3.3.2 突变体的筛选及验证
• 2.3.3 BMB171和突变株BMB1084比较
• 2.3.3.1 BMB171与突变株BMB1084生长情况的比较
• 2.3.3.2 BMB171与突变株BMB1084芽胞形成的比较
• 2.3.4 Enhancin蛋白基因对Bt杀棉铃虫幼虫的增效杀虫活性
• 2.3.4.1 晶体蛋白基因cry1Ac10在BMB171和突变株BMB1084表达
• 2.3.4.2 生物测定
• 2.4 讨论
• 参考文献
• 致谢
• 附录