论文摘要
第一部分:匹罗卡品致痫大鼠海马GABA能中间神经元的数目变化及其轴突出芽的研究背景与目的颞叶癫痫是临床最常见的难治性癫痫之一,迄今为止其发病机制仍不明确。海马兴奋性回路的增强和抑制性回路的减弱在颞叶癫痫发生中起着极为重要的作用。研究认为兴奋性回路的建立虽然参与了颞叶癫痫的发生,但并不足以解释自发性痫性发作的原因。于是与海马抑制性回路密切相关的GABA能中间神经元逐渐成为目前的研究热点。GABA能中间神经元的缺失及其轴突出芽是GABA能抑制减弱、恢复或增强的主要原因。关于颞叶癫痫GABA能传递的研究至今还存在极大的争议,且不同亚类中间神经元在不同模型不同部位对痫性发作所致损伤的敏感性不同,因此颞叶癫痫模型GABA能中间神经元的缺失及其轴突出芽还需进一步深入研究。本研究拟建立匹罗卡品致痫模型,在不同时间点观察致痫大鼠海马GABA能中间神经元（SS、NPY、PV）的数目变化及其轴突出芽,结合Fluoro Jade B（FJB）的免疫荧光双标技术特异性检测中间神经元及其轴树突是否存在变性,揭示GABA能中间神经元在颞叶癫痫的发生和自我修复中的作用,为难治性癫痫治疗新思路的探讨提供更多的理论依据。方法1)模型制作与分组:健康雄性6～8周龄SD大鼠120只随机分为实验组（A组,n=80）和对照组（B组,n=40）,两组又随机各分为8个亚组（A1～8亚组,n=10;B1～8亚组,n=5）。A组颞叶癫痫模型制作采用氯化锂加匹罗卡品腹腔注射法;B组大鼠腹腔注射等量无菌生理盐水。根据Racine标准判定癫痫发作的程度。选取痫性发作后2小时、6小时、1天、3天、7天、15天、30天、60天为研究时间点,海马CA1区、CA3区、齿状回为研究部位。2)不同时间点行尼氏染色观察海马病理改变,行FJB染色观察海马神经元及其轴树突变性。3)免疫组化方法检测各时间点海马不同区域SS、NPY和PV阳性中间神经元的数目变化及其轴突出芽情况。4)与FJB结合的免疫荧光双标技术特异性检测SE（statusepilepticus,癫痫持续状态）后7d和60d海马不同区域SS、NPY和PV阳性中间神经元及其轴树突的变性情况。结果1)实验组大鼠腹腔注射氯化锂-匹罗卡品后,SE诱发成功率为92.5%,死亡率21.25%。2)尼氏染色结果显示:实验组海马神经元缺失以SE后7d和60d最为明显。除齿状回颗粒细胞缺失相对较轻（P＜0.05）外,CA区域锥体细胞和门区神经元均显著减少（P＜0.01）。3)FJB染色结果显示:各时间点中,实验组以SE后7d和60d海马神经元变性最明显,主要集中在CA区域锥体细胞层和门区,SE后7d海马腔隙-分子层（1m层）亦可见变性的轴突树突。4)实验组大鼠海马各区SS阳性神经元数目均在SE后7d减至最低（P＜0.01）,慢性期开始部分恢复,SE后60d时CA1区SS神经元数目超过对照组（P＜0.01）,但门区和CA3区SS神经元仍明显低于正常水平（P＜0.01）;SE后30天海马回1m层和齿状回外分子层出现大量SS染色的纤维,60d时海马CA1区全层均可见大量增多的SS阳性纤维。5)实验组大鼠海马门区NPY阳性神经元数目在SE后下降,至7d时降至最低（P＜0.01）,慢性期开始恢复,SE后60d时NPY神经元数目与对照组相比仍有减少（P＜0.05）;CA区域除SE后7d CA3区NPY神经元数目稍减少（P＜0.05）外,其余时段均无明显变化（P＞0.05）;SE后30dlm层和齿状回分子层可见增多的NPY阳性纤维。6)实验组大鼠海马门区PV阳性神经元在SE后早期无明显变化（P＞0.05）,慢性期时下降（P＜0.01）。海马CA1区PV阳性神经元在SE后15d时开始明显增多（P＜0.01）,可见相应增多的PV阳性纤维;海马CA3区PV阳性神经元在SE后即持续增多,至60d时最多（P＜0.01）,并可见相应增多的PV阳性纤维。7)免疫荧光双标结果显示:实验组中SE后7d的海马CA1区、60d的CA1区、CA3区和门区均可观察到少部分被FJB染色的SS阳性中间神经元胞体及其轴突树突;NPY染色的中间神经元仅在SE后60d门区有部分亦被FJB染色;未见明显被PV和FJB双标记的中间神经元。结论1)不同亚类中间神经元在不同部位不同时段对颞叶癫痫所致损伤的敏感性不同,尤以门区树突型抑制性中间神经元对损伤最为敏感。2)抑制性GABA能中间神经元的缺失在颞叶癫痫发生中起重要作用;树突型GABA能中间神经元的缺失部分由于神经元的变性死亡,而胞周型GABA能中间神经元的缺失可能与神经元变性死亡无关。3)抑制性GABA能中间神经元的轴突出芽,特别是慢性期CA1区SS阳性纤维的大量增多,可能在颞叶癫痫的发生和自我修复中起重要作用。第二部分荧光金逆行示踪观察匹罗卡品致痫大鼠CA1区神经元突触联系变化的研究背景与目的海马兴奋性回路和抑制性回路的重组与颞叶癫痫的发生密切相关。轴突出芽是颞叶癫痫的普遍现象,是兴奋性回路和抑制性回路重组的重要结构基础。虽然目前已有大量关于兴奋性回路重组的报道,但颞叶癫痫中兴奋性主细胞的突触联系变化尚不十分清楚;而有关GABA能抑制性回路重组的研究仍很少,特别是颞叶癫痫慢性期抑制性中间神经元之间的突触联系变化更是知之甚少。关于第一部分的研究发现,颞叶癫痫慢性期CA1区出现大量增多的SS阳性纤维,这极可能构成了异常的抑制性突触联系。本研究拟利用氯化锂-匹罗卡品致痫大鼠模型,通过荧光金逆行示踪观察慢性自发发作期海马CA1区锥体细胞之间的突触联系变化,并与免疫荧光技术结合,首次观察慢性期CA1区异常增多的SS阳性纤维的起源和抑制性中间神经元之间的突触联系变化,揭示兴奋性和抑制性回路重组在颞叶癫痫的发生和自我修复中所起的作用。方法1)模型制作与分组:健康雄性6～8周龄SD大鼠20只随机分为实验组（A组,n=10）和对照组（B组,n=10）。A组颞叶癫痫模型制作采用氯化锂加匹罗卡品腹腔注射法;B组大鼠腹腔注射等量无菌生理盐水。根据Racine标准判定癫痫发作的程度。2)SE后60天左右,利用立体定位仪在活体内注射逆行性示踪剂荧光金（Fluoro Gold,FG）至海马CA1区,对照组大鼠亦于同一时期注射等量FG至海马CA1区,术后常规喂养5～7天后灌注取材。3)行关于SS的免疫荧光染色,激光扫描共聚焦显微镜下观察FG的分布以及SS和FG的共标记情况。结果1)实验组大鼠腹腔注射氯化锂-匹罗卡品后,1只致痫失败,2只因抽搐致死,剩余7只进入静止期。2)FG注射部位区域,两组均可见大量被FG标记的锥体细胞;CA1区远离注射部位处,7只实验组大鼠中有5只被发现有FG标记的锥体细胞,对照组未见;实验组中有2只大鼠在海马下托亦发现有FG标记的锥体细胞,对照组未见。3)FG注射部位区域,两组均可见被FG标记的SS阳性神经元,双标记SS神经元占总SS神经元的比值两组无明显差异（P＞0.05）;CA1区远离注射部位处,实验组大鼠均可见被FG标记的SS阳性神经元,而对照组未见;实验组中有2只大鼠在CA3区亦见少数被FG染色的SS中间神经元,对照组未见。结论1)颞叶癫痫大鼠海马CA1区锥体细胞之间和下托至CA1区的异常兴奋性突触联系,可能是构成异常兴奋性回路的解剖学基础,并在颞叶癫痫发生中起促进作用。2)颞叶癫痫大鼠海马CA1区SS阳性中间神经元之间存在异常抑制性突触联系,CA1区增多的SS阳性纤维可能部分来源于CA1远隔区域SS中间神经元增强的轴突出芽,这可能导致异常的抑制性回路的形成,并在癫痫的发生和自我修复中起重要作用。
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