细菌短链脱氢酶的克隆表达及催化特性研究

论文摘要

短链脱氢酶广泛存在微生物细胞之中,除了在生理功能上涉及糖、醇、脂类、氨基酸、碳氢化合物、辅酶、荷尔蒙、异生物质等多种代谢,还是一类在生物催化与转化上备受关注的生物催化剂,在理论和应用方面的研究具有重要意义。本实验以三种不同菌种基因组为模板,PCR扩增得到三个短链脱氢酶基因,分别构建表达质粒并在E. coli BL21（DE3）中表达,并研究了相关酶学性质,结果如下：1.从荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens GZM1.49）基因组DNA克隆得到了编码短链脱氢酶的基因pfd,该基因全长684bp,编码227个氨基酸。重组PFD分子大小为28kDa,具有嗜冷酶的催化特征,能氧化4-氯-3-羟基丁酸乙酯、1-苯乙醇、苯甲醇、仲丁醇和还原4-氯-乙酰乙酸乙酯、2-溴-苯乙酮、4-溴-苯乙酮等底物。以4-氯-3-羟基丁酸乙酯为底物时活力最高,Km值为186.90mmol/L, Vmax为89.56U/mg。氧化4-氯-3-羟基丁酸乙酯时,最适反应温度和pH分别为12℃和10.5,倾向于利用NAD+作辅酶；而还原4-氯-乙酰乙酸乙酯时,最适温度和pH为24℃和8.8,倾向于利用NADPH作辅酶。重组PFD能耐受50%（V/V）的甲醇等有机助溶剂,低浓度的EDTA对其酶活有一定的促进作用。2.从地表地芽孢杆菌Geobacillus subterraneus基因组DNA克隆得到了编码短链脱氢酶的基因gsd,该基因全长555bp,编码184个氨基酸。重组GSD分子大小为24kDa,具有嗜热酶的催化特征,底物谱较广。以丙酮酸乙酯为最适氧化底物,Km值为20.25mmol/L,Vmax为238.10U/mg,最适反应温度和pH分别为65℃和10.5；还原乳酸乙酯时,最适温度和pH为65℃和7.5。重组GSD既能耐受浓度高达70%(V/V的甲醇溶剂,又能同时利用NAD（H）和NADP（H）,可用于构建辅酶再生体系。除此之外,重组GSD热稳定性强,低浓度的金属离子和EDTA对其酶活的影响不大。3.从铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa A006）基因组DNA克隆得到的编码短链脱氢酶的基因pad,该基因全长825bp,编码274个氨基酸,理论计算重组PAD分子大小为30kDa。BLAST分析显示该基因序列与Pseudomonas aeruginosa PAO1（ABJ12131）短链脱氢酶基因的同源性为100%。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 引言
• 1.2 醇脱氢酶来源
• 1.2.1 人和动物来源的醇脱氢酶
• 1.2.2 植物来源的醇脱氢酶
• 1.2.3 微生物来源的醇脱氢酶
• 1.3 醇脱氢酶分类
• 1.4 脱氢酶在合成手性物质中的研究进展
• 1.5 脱氢酶酶学性质研究
• 1.5.1 嗜热脱氢酶酶学性质研究
• 1.5.2 常温脱氢酶酶学性质
• 1.5.3 嗜冷脱氢酶酶学性质研究
• 1.6 本论文的研究背景、内容及意义
• 参考文献
• 第二章 荧光假单胞菌短链脱氢酶的克隆表达及酶学性质分析
• 2.1 引言
• 2.2 实验材料
• 2.2.1 菌种及质粒载体
• 2.2.2 试剂
• 2.2.3 培养基
• 2.2.4 主要仪器
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 目的基因的克隆
• 2.3.1.1 菌种培养
• 2.3.1.2 引物设计
• 2.3.1.3 基因组提取
• 2.3.1.4 目的基因pfd的PCR扩增
• 2.3.1.5 目的基因pfd与pMD-18T simple vector的连接
• 2.3.2 重组表达质粒pET-pfd的构建
• 2.3.3 重组质粒pET-pfd的表达
• 2.3.4 重组酶的纯化
• 2.3.5 重组酶酶活测定
• 2.3.6 重组酶酶学性质
• 2.3.6.1 底物特异性
• 2.3.6.2 pH变化对酶活力的影响
• 2.3.6.3 温度变化对酶活力的影响
• 2.3.6.4 动力学常数
• 2.3.6.5 有机溶剂耐受性
• 2.3.6.6 金属离子对酶活性的影响
• 2.4 结果与分析
• 2.4.1 短链脱氢酶PFD的基因克隆及分子特征
• 2.4.2 重组表达质粒pET-pfd的构建
• 2.4.3 重组表达质粒pET-pfd的构建
• 2.4.4 重组酶酶学性质
• 2.4.4.1 底物特异性
• 2.4.4.2 最适pH
• 2.4.4.3 最适温度
• 2.4.4.4 动力学常数
• 2.4.4.5 有机溶剂耐受性
• 2.4.4.6 金属离子对重组PFD活力的影响
• 2.5 本章小结
• 参考文献
• 第三章 地表地芽孢杆菌短链脱氢酶的克隆表达及酶学性质分析
• 3.1 引言
• 3.2 实验材料
• 3.2.1 菌种及质粒载体
• 3.2.2 试剂
• 3.2.3 培养基
• 3.2.4 主要仪器
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 目的基因的克隆
• 3.3.1.1 菌种培养
• 3.3.1.2 引物设计
• 3.3.1.3 基因组提取
• 3.3.1.4 目的基因gsd的PCR扩增
• 3.3.1.5 目的基因gsd与pMD-18T simple vector的连接
• 3.3.2 重组表达质粒pET-gsd的构建
• 3.3.3 重组质粒pET-gsd的表达
• 3.3.4 上罐发酵
• 3.3.4.1 种子液培养
• 3.3.4.2 5 L发酵罐发酵
• 3.3.4.3 重组菌生长曲线测定
• 3.3.5 重组酶的纯化
• 3.3.6 重组酶酶活测定
• 3.3.7 重组酶酶学性质
• 3.3.7.1 底物特异性
• 3.3.7.2 pH变化对酶活力的影响
• 3.3.7.3 温度变化对酶活力的影响
• 3.3.7.4 热稳定性
• 3.3.7.5 动力学常数
• 3.3.7.6 有机溶剂耐受性
• 3.3.7.7 金属离子对酶活性的影响
• 3.4 结果与分析
• 3.4.1 短链脱氢酶GSD的基因克隆及分子特征
• 3.4.2 重组表达质粒pET-gsd的构建
• 3.4.3 重组表达质粒pET-gsd的构建
• 3.4.4 重组菌发酵生长曲线
• 3.4.5 重组酶酶学性质
• 3.4.5.1 底物特异性
• 5.4.5.2 最适pH
• 3.4.5.3 最适温度
• 3.4.5.4 热稳定性
• 3.4.5.5 动力学常数
• 3.4.5.6 有机溶剂耐受性
• 3.4.5.7 金属离子对重组GSD活力的影响
• 3.5 本章小结
• 参考文献
• 第四章 铜绿假单胞菌短链脱氢酶的克隆表达
• 4.1 引言
• 4.2 实验材料
• 4.2.1 菌种及质粒载体
• 4.2.2 试剂
• 4.2.3 培养基
• 4.2.4 主要仪器
• 4.3 实验方法
• 4.3.1 目的基因的克隆
• 4.3.1.1 菌种培养
• 4.3.1.2 引物设计
• 4.3.1.3 基因组提取
• 4.3.1.4 目的基因pad的PCR扩增
• 4.3.1.5 目的基因pad与pMD-18T simple vector的连接
• 4.3.2 重组表达质粒pET-pad的构建
• 4.4 结果与分析
• 4.4.1 短链脱氢酶PAD的基因克隆及分子特征
• 4.4.2 重组表达质粒pET-pad的构建
• 4.5 本章小结
• 参考文献
• 第五章 总结与展望
• 5.1 结论
• 5.2 展望
• 攻读硕士学位期间发表论文情况
• 致谢