Ndc80复合物可塑性及动态组装分子机制研究

论文摘要

染色体的不稳定性或异常分离被广泛认为是癌症发生的标志性事件,细胞有丝分裂过程中染色体的正确运动与分离是由纺锤体微管和动点的相互作用来协调实现的。我们早期的研究发现,中心体激酶Nek2A在有丝分裂时期中有新颖的动点定位,敲除Nek2A将导致染色体的不稳定性,然而Nek2A如何参与纺锤体检验点信号途径还不甚清楚。Hec1是动点-微管核心衔接点Ndc80复合物的主要组分,但Hec1在癌症细胞中高表达的原因一直未能攻克。我们最新的研究发现,Nek2A通过磷酸化Hec1调控其与动点内层结构蛋白质CENP-H之间的相互作用,我们拟从Hec1在有丝分裂过程中的地位和精细调控入手,来揭示其与癌症发生的关联以及Nek2A介导的新颖的动点组装途径。我们证实了Spc24-Spc25亚复合物直接结合CENP-H的N端1-105 aa,Hec1通过C端超卷曲螺旋和亮氨酸富集区（461-642 aa）结合在CENP-H的中心包含超卷曲螺旋的106-148 aa区域,合理分配了CENP-H提供的装配平台。Nek2A在有丝分裂过程中能磷酸化Hec1的Ser165位点并借此调控Hec1和CENP-H之间的相互作用。颇有意思的是,Nek2A介导的磷酸化调控并不决定Hec1的动点定位。然而,在过表达模拟Hec1非磷酸化突变体的中期细胞中出现部分富集极区的滞后染色体和大量syntelic错误连接,进一步观察发现,后期个别染色体不能完全分离,姐妹染色单体之间保持桥联。我们把所有的表型归结为Nek2A的动态磷酸化影响Hec1的微管亲和力差异,并通过体外微管共沉淀实验得以验证。综上所述我们提出了新颖的分子模型,我们认为Nek2A介导的磷酸化引起Hec1的N端球状区域发生取向改变,一方面通过Hec1-CENP-H相互作用驱使Ndc80复合物收敛承接臂,促进动点紧凑和应力传承,另一方面上调Hec1的微管亲和力和结合数量,迅速建立动点.微管双极连接,从而将动点组装、微管连接和纺锤体检验点信号通路有机整合。为了进一步揭示有丝分裂过程中Ndc80复合物的过渡型结构特性及其验证我们提出的“时序组装”假设,我们应用了新颖的SNAP实时标记技术,并发现体内Spc24-Spc25拥有两个具差异动态性和功能性的储备库,其中核仁储备库侧重于在Hec1-Nuf2之前快速锚定动点,胞浆储备库则侧重于保障动点定位的饱和度。Ndc80的时序组装模型很好地诠释了其复合过渡型的功能特征,并将动点内层结构的缜密性衔接和外层空间的微管捕获特性高效地耦合。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 文献综述
• 1.1 细胞有丝分裂周期
• 1.2 动点蛋白质复合物
• 1.3 动点-微管双极定向连接
• 1.4 动点-微管核心衔接点
• 1.5 纺锤体检验点
• 1.6 蛋白质激酶信号级联
• 1.7 小结
• 附表:人类动点蛋白质同源物
• 第2章 实验材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.2 实验方法
• 第3章 Ndc80复合物可塑性分子机制研究
• 3.1 引言
• 3.2 Hecl与CENP-H的相互作用和定位关系
• 3.2.1 Hecl-CENP-H相互作用的潜在性分析
• 3.2.2 Hecl-CENP-H相互作用的体外生化验证
• 3.2.3 Hecl-CENP-H相互作用的体内定位考察
• 3.2.4 小结
• 3.3 Nek2A磷酸化Hecl的功能调控
• 3.3.1 Nek2A磷酸化Hecl的潜在性分析
• 3.3.2 Nek2A磷酸化Hecl的体外生化验证
• 3.3.3 Nek2A磷酸化Hecl的体内时相验证
• 3.3.4 Nek2A磷酸化对Hecl-CENP-H相互作用的影响
• 3.3.5 Nek2A磷酸化对Hecl定位的影响
• 3.3.6 Nek2A磷酸化Hecl的功能解析
• 3.3.7 小结
• 第4章 Ndc80复合物动态组装分子机制研究
• 4.1 引言
• 4.2 SNAP融合蛋白质标记技术及在Ndc80复合物中的应用
• 4.2.1 SNAP融合蛋白质标记技术
• 4.2.2 SNAP脉冲标记法分析Spc24-Spc25的定位时序
• 4.2.3 SNAP淬灭后脉沖标记法分析Spc24-Spc25的定位时序
• 4.2.4 SNAP脉冲标记法结合RNA干扰分析Spc24-Spc25的定位时序
• 4.2.5 SNAP实时脉冲标记法分析Spc24-Spc25的定位时序
• 4.2.6 小结
• 第5章 总结与展望
• 5.1 总结
• 5.1.1 Ndc80复合物可塑性分子机制研究总结
• 5.1.2 Ndc80复合物动态组装分子机制研究总结
• 5.2 展望
• 参考文献
• 致谢
• 在读期间发表的学术论文与取得的其他研究成果