线粒体单倍型与牛克隆效率的研究

论文摘要

体细胞核移植（Somatic Cell Nuclear Transfer, SCNT）是又一种评估核发育潜能以及分析供核与受体胞质相互关系的有效手段。但目前SCNT的效率仍低,制约它的发展和应用。研究表明,移植于卵母细胞质中的供核基因获得准确的重编程是保证克隆胚胎的形成、发育以及个体的正常生长等的关键。基因重编程过程中一系列生物学功能的变化则是核-胞质相互作用的结果。核-胞质的相互关系成为SCNT重编程研究的重要的内容。卵母细胞胞质中的线粒体（mitochondrion, Mt）受核基因组和线粒体基因组的双重控制,这为研究核质互作提供了非常良好的研究对象。由于线粒体基因组的高突变率,引起不同种群间及同一种群不同个体间mtDNA序列的差异,表现出不同的单倍型,国内外研究表明,mtDNA单倍型与牛体外胚胎生产（IVP）效率有关。本课题通过聚合酶链式反应（PCR）与限制性内切酶片断长度多态性（RFLP）相结合将实验动物按照外周血mtDNA的限制性酶切图谱划分为A、B、C、D四种线粒体单倍型,并选择在群体中分布较多的A型和C型实验动物作为主要研究对象,通过活体取卵（Ovum Pick-Up,OPU）获得卵母细胞,并培养不同类型的牛耳成纤维细胞和卵丘细胞作为供核者,进行核移植。结果显示同型核移植的囊胚发育率明显高于异型核移植（45.0%和29.0%,p<0.05）。证明供核细胞与卵母细胞线粒体单倍型是否匹配对核移植效率有影响。并进一步发现,当卵母细胞与供核细胞同为A型时,克隆囊胚的发育率最高（53.4%）,明显高于其他组合方式（C-C,A-C,C-A,分别为41.8%,34.3%和24.4%,p<0.05）,提示此种组合方式最有利于克隆胚胎的发育。为深入了解同型与异型的克隆囊胚之间的差异,进一步揭示核质互作的机理,我们分别将同型与异型核移植所得的囊胚进行H3-K9甲基化分析。结果显示,同型胚胎中正常甲基化的比例与IVF胚胎相似（40% vs.75%,p>0.05）。本课题将分子生物学技术与胚胎工程技术相结合,针对体细胞克隆重编程中核-质互作的关键问题,通过活体取卵（OPU）对遗传背景清楚的卵母细胞进行研究,并从表观遗传的角度深入探讨克隆机理,为提高哺乳动物的克隆效率提供新的思路和技术方法,具有重要的理论意义和应用价值。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 1. 转基因动物与乳腺生物反应器
• 2. 体细胞核移植技术
• 3. 线粒体与体细胞核移植
• 4. 本研究的目的及主要内容
• 参考文献
• 实验流程图
• 第一部分 线粒体 DNA 单倍型的确立
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验方法
• 1.3 实验结果
• 1.4 实验讨论
• 参考文献
• 第二部分 线粒体 DNA 单倍型与牛克隆效率的研究
• 2.1 实验材料
• 2.2 实验方法
• 2.3 实验结果
• 2.4 实验讨论
• 参考文献
• 第三部分 线粒体DNA 单倍型与牛克隆效率的机制研究
• 3.1 实验材料
• 3.2 实验方法
• 3.3 实验结果
• 3.4 实验讨论
• 参考文献
• 小结
• 附图
• 附录
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术文章