论文摘要
目的探讨Ⅰ型钙黏蛋白（Cadherin 1,CDH1）基因甲基化及其功能蛋白表达与肺癌的相关性。方法通过对实验条件的探讨,引进了半定量荧光甲基化特异PCR（MSP）检测CDH1甲基化的方法和建立了相对定量巢式PCR（RT-PCR）检测E-cad mRNA方法。再应用改进后半定量荧光甲基化特异MSP和所建立的相对定量巢式逆转录RT-PCR和免疫印迹法（Westem Blot,WB）检测50例肺癌患者的癌、癌旁和远癌组织及5例非肺癌对照肺组织中CDH1甲基化、mRNA相对表达和Ⅰ型钙黏蛋白（E-cadherin,E-cad）表达的情况,并对部分表达阴性标本用免疫组化法进行验证。结果1.通过对实验条件的探讨,检测CDH1 DNA甲基化半定量荧光MSP反应体系为dATP,dCTP和dGTP 200gmol/L,dUTP 400μmol/L,MgC12 3.0mmol/%,引物600nmol/L,热启动Taq DNA聚合酶0.04U/μl,模板3μl,DMSO 2.5%,1×SYBGREENⅠ染料,1×反应缓冲液,总体系25μl。反应条件为95℃预变性12 min,95℃15 sec、退火温度1min（其中62℃2个循环、60℃3个循环和58℃45个循环）、69℃10 sec,循环次数50。2.应用所改进和建立的半定量荧光MSP技术检测CDH1启动子甲基化相对比值癌组织为0.0013～4.5067、中位数0.2723,癌旁组织为0.0000～0.7545、中位数0.2268,远癌组织为0.0000～1.4516、中位数0.1191。经秩和检验分析表明,癌和癌旁组织、癌和远癌组织、癌旁和远癌组织、远癌组织与非肺癌对照肺组织中CDH1甲基化水平差异有统计学意义,癌组织、癌旁组织和远癌组织中各病理分型的CDH1基因甲基化相对比值的差异无统计学意义。3.通过对实验条件的探讨,检测E-cad mRNA相对定量巢式RT-PCR反应体系为dNTP 200μmol/L,MgC12 1.5mmol/L,引物600nmol/L,Taq DNA聚合酶0.1U/μl,模板50ng,10×反应缓冲液2.5μl,总体系25μl。反应条件为95℃预变性10min,95℃1min、66℃1min、72℃1min,第一次PCR为25个循环,第二次PCR和1β-actin为35个循环,最后72℃延伸10min。4.应用所建立的巢式RT-PCR检测CDH1 mRNA表达的相对比值,癌组织1.33±0.53、癌旁组织1.65±0.60、远癌组织2.01±0.46、非肺癌对照肺组织2.09±0.09,经方差分析癌、癌旁和远癌组织之间的差异有统计学意义（F=18.810,P＜0.01）,但远癌组织与非肺癌对照肺组织之间的差异无统计学意义P＞0.05。巢式RT-PCR结果还显示鳞癌、腺癌及腺鳞癌的癌组织、癌旁组织和远癌组织中E-cad mRNA水平差异无统计学意义P＞0.05。5.WB结果显示,癌组织E-cad阳性率为38.0%（19/50）、癌旁组织为70.0%（35/50）、远癌组织为96.0%（48/50）,经卡方检验分析癌、癌旁和远癌组织差异有统计学意义（x2=38.79,P=0.000,＜0.05）。WB结果还显示鳞癌、腺癌及腺鳞癌的癌组织、癌旁组织和远癌组织中E-cad表达水平差异无统计学意义,表明E-cad表达水平与肺癌的组织类型无关。6.免疫组化法验证5份WB表达阴性标本结果显示,5份癌组织细胞E-cad表达均缺失。结论从甲基化、mRNA和蛋白三个方面表明E-cad异常甲基化和蛋白表达减少可能是伴随肺癌发生和发展过程的重要因素。肺癌患者癌组织CDH1启动子发生甲基化,并抑制该基因的转录,进而影响E-cad蛋白的表达。从甲基化水平、mRNA和蛋白表达三个方面表明E-cad表达水平与肺癌的组织类型无关。