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鸡Toll样受体1/2基因的克隆、表达及功能的初步研究

2020-12-16阅读(951)

鸡Toll样受体1/2基因的克隆、表达及功能的初步研究

论文摘要

Toll样受体（Toll-like receptors, TLRs）是先天免疫系统重要的模式识别受体（pattern recognition receptors, PRR）,它属于Ⅰ型跨膜蛋白。这类受体在机体的先天免疫应答中具有识别入侵的病原微生物,引起机体炎症反应从而有助于清除病原的重要作用。目前已经识别了10种鸡的Toll样受体（chicken toll-like receptor, chTLRs）。本课题通过设计4对引物分别对chTLR2家族的4个成员1LA、1LB、2t1和2t2的含ORF全长基因序列进行扩增,并串联Lumio标签序列。将扩增基因片段克隆进真核表达载体pVITRO1-neo-mcs,通过PCR和双酶切鉴定,证实成功构建了pVITRO1-neo-mcs-chTLR1LA、1LA、2t1和2t2四个重组真核表达质粒。并将这些重组质粒单个和两两组合共10组分别稳定转染Vero细胞,通过RT-PCR、蛋白PAGE凝胶电泳（Lumio融合蛋白）对重组质粒的表达情况进行检测。检测结果显示,成功获得了能够稳定表达重组质粒的T1-T10 vero细胞系。将检测质粒pNiFty2-SEAP稳定转染T1-T10Vero细胞株,构建T1’-T10’Vero细胞系,分别以含10μg/mL的LPS和Zymosan的HEK-BlueTM Detection刺激T1’-T10’Vero细胞系,同时设定无刺激对照组、阴性对照组（vero细胞转染检测质粒）和空白对照组。刺激9h后观察颜色变化并测定其OD值。LPS刺激组中的T1’、T3’和T9’Vero细胞株,Zymosan刺激组中的T9’Vero细胞株,无刺激对照组中的T4’和T8’Vero细胞株的分泌型碱性磷酸酶浓度（SEAP）均与极显著高于阴性对照组（P<0.01）。本课题研究结果表明,在chTLR2家族对LPS识别过程中,可能需要chTLR1LA单体、chTLR2t1单体和chTLR1LA与chTLR1LB复合物的参与；在chTLR2家族对Zymosan识别过程中,可能需要chTLR1LA与chTLR1LB复合物的参与；而无刺激对照组的检测结果表明,chTLR2t2单体活化NF-κB的作用比实验中所采用的其它单体和复合物更强,说明chTLR2t2单体可能对某些病原具有配体识别功能。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 主要中英文对照表
  • 目录
  • 前言
  • 第一章 Toll样受体概况
  • 1.1 鸡的Toll样受体
  • 1.1.1 禽类TLR1和TLR2亚家族及其作用模式
  • 1.1.2 禽类独特的TLR15及其效应
  • 1.1.3 脊椎动物保守的TLRs在禽类的分子进化及作用机制
  • 1.1.4 Toll样受体的应用前景
  • 1.2 脊椎动物TLR2亚家族结构与功能
  • 1.2.1 TLR2亚家族结构特点
  • 1.2.2 TLR2亚家族功能特点
  • 1.3 开展本课题研究的目的和意义
  • 第二章 鸡Toll样受体1/2基因的克隆
  • 2.1 材料和方法
  • 2.1.1 材料处理
  • 2.1.2 主要试剂
  • 2.1.3 PBMC的核酸提取
  • 2.1.4 反转录合成cDNA
  • 2.1.5 引物设计和目的基因片段的扩增
  • 2.2 结果
  • 2.2.1 ChTLR1LA基因的PCR扩增结果
  • 2.2.2 ChTLR1LB基因的PCR扩增结果
  • 2.2.3 ChTLR2t1基因的PCR扩增结果
  • 2.2.4 ChTLR2t2基因的PCR扩增结果
  • 2.3 讨论
  • 第三章:鸡Toll样受体1/2重组质粒的构建
  • 3.1 材料和方法
  • 3.1.1 菌株及载体
  • 3.1.2 主要试剂
  • 3.1.3 鉴定引物的设计与合成
  • 3.2 重组质粒的构建
  • 3.2.1 pVITRO1-neo-mes载体的酶切
  • 3.2.2 DH5α E.coli感受态细胞的制备
  • 3.2.3 插入的目的片段的双酶切
  • 3.2.4 重组质粒的连接、转化与鉴定
  • 3.2.5 重组质粒稳定转染前的准备
  • 3.3 结果
  • 3.3.1 重组质粒pVITRO1-neo-mes-chLR1LA的PCR鉴定
  • 3.3.2 重组质粒pVITRO1-neo-mcs-chTLR1LB的PCR鉴定
  • 3.3.3 重组质粒pVITRO1-neo-mcs-chTLR2t1的PCR鉴定
  • 3.3.4 重组质粒pVITRO1-neo-mcs-chTLR2t2的PCR鉴定
  • 3.3.5 酶切鉴定
  • 3.4 讨论
  • 第四章:鸡Toll样受体1/2重组质粒转染Vero细胞
  • 4.1 材料和方法
  • 4.1.1 细胞及载体
  • 4.1.2 主要试剂及配制
  • 4.1.3 重组真核表达质粒稳定转染Vero细胞
  • 4.1.4 G418对稳定转染重组质粒evro细胞的筛选
  • 4.1.5 转染后Vero细胞株的Toll样受体1/2的mRNA转录水平的检测
  • 4.1.6 转染后Vero细胞株的Toll样受体1/2表达水平的检测
  • 4.2 结果
  • 4.2.1 G418抗性筛选结果
  • 4.2.2 Vero细胞中chTLRs的mRNA转录水平的检测结果
  • 4.2.3 Vero细胞中重组质粒的蛋白表达的检测
  • 4.3 讨论
  • 第五章 鸡的TLR1/2复合物的功能的初步研究
  • 5.1 材料和方法
  • 5.1.1 细胞、载体及试剂
  • 5.1.2 主要试剂配制
  • 5.1.3 检测质粒pNiFty2-SEAP的转染T1-T10 Vero细胞株
  • 5.1.4 LPS、Zymosan刺激T1’-T10’Vero细胞株浓度的确定
  • TM Detection检测重组细胞表达的分泌型碱性磷酸酶活性'>5.1.5 HEK-BlueTMDetection检测重组细胞表达的分泌型碱性磷酸酶活性
  • 5.2 结果
  • 5.2.1 G418和博来霉素Zeocin对重组细胞的筛选
  • TM Detection检测结果'>5.2.2 HEK-BlueTMDetection检测结果
  • 5.3 讨论
  • 第六章 结论
  • 参考文献
  • 附录
  • 致谢
  • 个人简历
  • 攻读硕士学位期间所发表的学术论文及参与科研项目

    • 相关论文文献

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