论文摘要
阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD）是一种以渐进性记忆减退、认知障碍及人格改变为主要临床特征的中枢神经系统退行性变性疾病,已成为继心脏病、癌症和中风之后的第4号杀手,其主要病理特征为脑内老年斑沉积、神经元纤维缠结以及神经元变性。AD具有复杂的病理生理过程,受多种因素影响,其中氧化应激在AD发病过程中起着重要作用。香菇多糖（lentinan, LNT）是从香菇的子体中提取、分离、纯化的一组多糖成分,具有提高机体免疫、抗肿瘤、抗病毒、保肝解毒、抗氧化、降血糖、降血脂、抗炎抗感染等作用。香菇多糖在临床上已用于肿瘤、肝炎等的辅助治疗,但其在AD的作用还有待进一步研究。本课题采用过氧化氢（hydrogen peroxide, H2O2）作为外源性自由基生成系统,以SH-SY5Y细胞代替神经细胞作为实验对象,模拟神经细胞的氧化损伤,建立体外神经细胞氧化应激损伤模型,观察香菇多糖对氧化损伤的SH-SY5Y细胞的保护作用及其可能的机制,为其用于AD的治疗提供依据。1.香菇多糖对H2O2损伤SH-SY5Y细胞形态的影响细胞经处理后于倒置显微镜下观察并拍照。实验结果表明：正常组细胞胞体呈梭形、不规则的三角形或多边形,有较短的轴突和树突样突起；H2O2模型组细胞数量减少,胞体皱缩,且有的细胞呈圆形；与模型组相比,香菇多糖各浓度保护组细胞数量增多,胞体皱缩现象明显改善。2.香菇多糖对H2O2损伤SH-SY5Y细胞活力的影响采用MTT法检测细胞活力。实验结果显示：SH-SY5Y细胞经H2O2损伤后,细胞活力明显降低（P<0.01）；与模型组相比,0.1 mg/L香菇多糖保护组细胞活力增强（P<0.05）,1、10 mg/L香菇多糖保护组则细胞活力明显增强（P<0.01）。3.香菇多糖对H2O2损伤SH-SY5Y细胞LDH漏出率的影响收集氧化损伤处理后的SH-SY5Y细胞培养上清液和细胞裂解液,参照试剂盒说明分别测定培养上清液和细胞裂解液中的乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase, LDH）活性,计算细胞LDH漏出率。实验结果表明：H2O2模型组SH-SY5Y细胞细胞膜通透性增加,LDH漏出率显著增高（P<0.01）；与模型组相比,给予0.1、1、10 mg/L香菇多糖,可抑制细胞内LDH的释放,明显降低细胞LDH漏出率（P<0.01）。4.香菇多糖对H2O2损伤SH-SY5Y细胞内MDA含量和SOD活力的影响收集细胞裂解液,用考马斯亮蓝法定细胞内总蛋白量,参照丙二醛（malondialdehyde, MDA）、超氧化物歧化酶（superoxidase dismutase, SOD）检测试剂盒说明分别测定细胞内MDA含量、SOD活力。实验结果表明：细胞经H202氧化损伤后MDA含量显著增加（P<0.01）,SOD活力显著降低（P<0.01）；经香菇多糖0.1、1、10 mg/L处理后,细胞内MDA含量显著减少（P<0.01）,SOD活力显著增高（P<0.01）。5.香菇多糖对H2O2损伤SH-SY5Y细胞核形态的影响细胞经处理后,室温下以4%多聚甲醛固定,Hoechst 33258染色,在荧光显微镜下观察并拍照。实验结果表明：细胞经Hoechst 33258染色后,正常组细胞胞核染色均匀；H2O2模型组细胞胞核内可见致密的颗粒状荧光,呈现出凋亡细胞典型的核固缩、核断裂表现；香菇多糖各浓度保护组细胞则胞核形态趋于正常,凋亡细胞数量明显减少。6.香菇多糖对H2O2损伤SH-SY5Y细胞凋亡率的影响细胞经处理后,以Annexin V-FITC/PI双染后上流式细胞仪检测。实验结果表明：与正常组比较,H2O2模型组细胞的凋亡率明显升高（P<0.01）；而相对模型组,香菇多糖各浓度保护组细胞的凋亡率降低,差异有显著统计学意义（P<0.01）。7.香菇多糖对H2O2损伤SH-SY5Y细胞内Caspase-3蛋白表达的影响细胞经处理后,按Western blot方法检测Caspase-3蛋白表达。实验结果表明：H2O2模型组细胞Caspase-3蛋白表达明显增加（P<0.01）；经香菇多糖0.1、1、10mg/L处理后,细胞的Caspase-3蛋白表达则明显减少（P<0.01）。
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