芥菜型油菜黄籽基因克隆和黄籽形成机制分析

论文摘要

黄籽油菜品种与黑籽油菜品种比,具有种皮薄、含油量高、蛋白含量高和纤维素低等优点,长期以来国内外育种家将黄籽油菜选育作为油菜育种的主要研究方向之一。我国的栽培油菜主要有白菜型（Brassica rapa）、芥菜型（B. juncea）和甘蓝型（B. napus）三大类型。芥菜型油菜（Brassica juncea Czern&Coss,2n=36, AABB）是通过二倍体的白菜（B. rapa,2n=20, AA）和黑芥（B. nigra,2n=16, BB）种间杂交而来。芥菜型油菜同白菜型油菜一样,有丰富的黄籽资源,且黄籽性状由2个基因位点控制。在先前的研究中,我们已将芥菜型油菜A09染色体黄籽基因BjuA.YSC基因定位在0.9cM范围内。本研究进一步利用BC8F2代分离群体精细定位了BjuA.YSC基因,利用其紧密连锁标记筛选BAC文库和BAC测序确定了候选基因,并采用转录组技术解析黄籽及其近等基因系的种皮基因表达差异,主要取得了如下研究结果：1.利用已公布的白菜基因组序列、韩国白菜BAC序列开发标记和芸薹属植物A09连锁群已定位标记共316个标记进行筛选,发现其中31个标记与A09染色体控制种皮颜色的基因连锁。利用其中19个连锁标记分析1042株BC8F2植株,构建了4.77cM长的黄籽基因区域遗传图谱,将目的基因BjuA.YSC定位在标记Nal0A08与BnGMS351之间0.30cM内,并找到共分离标记S88-Ⅳ-2、H032N11-2和S121-Ⅰ-2。2.进一步利用白菜基因组序列和测序的芥菜型油菜BAC（末端）序列开发了46对引物,分析发现12个连锁标记,利用更大的BC8F2群体（5434株）进行精细定位,结果表明芥菜型油菜BAC（末端）序列标记68N6和132001R也与BjuA.YSC共分离,侧翼标记S134-16和S102-5相距都为0.04cM。3.利用BjuA.YSC的侧翼标记采用四维PCR法筛选芥菜型油菜作图群体亲本紫叶芥BAC文库,构建了BjuA.YSC基因区域约1Mb长的BAC重叠群。测序的BAC序列与拟南芥基因组序列进行BLAST分析,发现该区段编码66个基因,其中Gene24为拟南芥基因At4g09820（TRANSPARENT TESTA8, TT8）的同源基因,该基因是在类黄酮生物合成途径中起调控作用的转录因子基因,因此推测该基因为候选基因。根据BjuA.YSC基因区域序列的特征以及遗传距离和物理距离比的分析,推测该区域可能为近着丝粒区域。4.从上述作图群体的黑籽亲本紫叶芥和黄籽亲本四川黄籽中克隆TT8基因,发现各有2个拷贝,分别命名为BjuA.TT8和BjuB.TT8。 BjuA.TT8位于A09染色体,BjuB.TT8推测可能位于B组染色体。BjuA.TT8核苷酸序列在黄、黑籽亲本间不仅有SNP位点多态性,而且在黄籽亲本中有一段长为1275bp的序列插入,而BjuB.TT8的基因组序列在黄、黑籽亲本间没有差异。RT-PCR产物限制酶切分析表明四川黄籽BjuA.TT8中由于1275bp插入第7个外显子导致了该基因翻译提前终止。5.利用芯片技术和RNA-seq技术分析了芥菜型油菜黄籽亲本四川黄籽及其褐籽近等基因系NILA授粉后15天种皮中基因的表达,分别获得25和1304个差异表达基因,其中包括类黄酮合成途径基因。qRT-PCR分析进一步证实CHS、DFR、 LDOX, ANR等类黄酮合成基因在黄籽种皮中不表达或表达显著下调,说明这些基因与种皮颜色的形成密切相关。综上所述,在芥菜型油菜黄籽材料四川黄籽中由于BjuA.TT8基因第7外显子插入突变导致翻译提前终止,其编码的bHLH转录因子蛋白功能缺失,不能正常参与MBW转录因子复合体的形成,可能导致原花色素合成途径基因不能正常表达,种皮中不能合成原花色素,种皮透明,种子呈现胚的黄颜色,产生黄籽。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1 油菜种皮颜色研究进展
• 1.1 油菜决定种皮色泽的物质
• 1.2 油菜种皮颜色的遗传
• 1.2.1 白菜型油菜种皮颜色的遗传
• 1.2.2 芥菜型油菜种皮颜色的遗传
• 1.2.3 甘蓝型油菜种皮颜色的遗传
• 1.3 油菜种皮颜色基因定位研究
• 2 基因图位克隆技术及其应用
• 2.1 图位克隆技术环节
• 2.1.1 目的基因的标记定位
• 2.1.2 高质量大片段基因组文库的构建
• 2.1.3 目的基因区域物理图谱的构建
• 2.1.4 基因功能的验证
• 2.2 图位克隆技术的应用
• 3 RNA-SEQ技术研究进展
• 3.1 RNA-seq原理和方法
• 3.2 RNA-seq的应用领域
• 3.2.1 基因表达水平的研究
• 3.2.2 基因结构优化和新转录本发现
• 3.2.3 可变剪切和基因融合检测
• 4 本研究的目的意义
• 第二章 芥菜型油菜A09染色体种皮颜色基因的精细定位和候选基因预测
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 种皮颜色的鉴定
• 1.2.2 基因组DNA的提取
• 1.2.3 引物开发
• 1.2.4 PCR程序和体系
• 1.2.5 PCR产物电泳检测
• 1.2.6 标记连锁分析
• 1.2.7 BAC文库的构建
• 1.2.8 BAC文库DNA混合池的构建
• 1.2.9 BAC单克隆的筛选
• 1.2.10 BAC末端测序和序列分析
• 1.2.11 BAC克隆的全长测序及分析
• 3 结果与分析
• 3.1 芥菜型油菜作图群体种皮颜色的遗传分析
• 3.2 芥菜型油菜A09染色体黄籽基因连锁标记分析
• 3.3 芥菜型油菜A09染色体黄籽基因的定位
• 3.4 芥菜型油菜A09染色体黄籽基因目的区域BAC重叠群构建
• 3.4.1 BAC文库筛选
• 3.4.2 目的区域重叠群构建
• 3.5 BAC末端序列分析
• 3.6 测序BAC的序列分析
• 3.7 芥菜型油菜A09染色体种皮颜色候选基因预测
• 4 讨论
• 第三章 芥菜型油菜黄、黑籽材料Bju.TT8基因的序列比较和表达分析
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 总DNA的分离
• 1.3 种皮总RNA提取
• 1.4 cDNA合成
• 1.5 引物设计和合成
• 1.6 PCR反应体系和扩增程序
• 1.7 PCR产物的克隆、测序
• 1.8 序列分析
• 2 结果与分析
• 2.1 芥菜型油菜作图群体黄、黑籽亲本种皮颜色候选基因TT8的克隆
• 2.2 芥菜型油菜Bju.TT8基因的染色体分布
• 2.3 芥菜型油菜Bju.TT8基因序列分析
• 2.4 芥菜型油菜Bju.TT8基因预测的蛋白序列比较与进化分析
• 2.5 芥菜型油菜黄、黑籽亲本Bju.TT8基因的序列比较
• 2.6 芥菜型油菜Bju.TT8基因在芥菜型油菜种皮中的表达分析
• 3 讨论
• 第四章 芥菜型油菜黄、褐籽种皮转录组比较分析
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 种皮RNA的提取
• 1.2.2 芯片杂交及数据处理
• 1.2.3 芥菜型油菜种皮转录组测序（RNA-seq）
• 1.2.4 RNA-seq数据预处理
• 1.2.5 RNA-seq数据组装
• 1.2.6 Unigene的注释
• 1.2.7 Unigene表达量统计和基因差异表达分析
• 1.2.8 cDNA的合成
• 1.2.9 实时荧光定量PCR（qRT-PCR）
• 2 结果与分析
• 2.1 芥菜型油菜种皮提取的RNA的浓度和质量检测
• 2.2 芥菜型油菜四川黄籽与其褐籽近等基因系种皮表达差的的芯片分析
• 2.3 芥菜型油菜种皮转录组数据组装分析
• 2.4 芥菜型油菜种皮unigenes的功能注释
• 2.4.1 NCBI非冗余（Non redundant,Nr）蛋白质数据库注释结果
• 2.4.2 基因本体（Gene Ontology,GO）分类
• 2.4.3 同源组聚类（Cluster of Orthologous Groups,COG）分析
• 2.4.4 京都基因与基因组百科全书摹（Kyoto Encyclopedia of Genes andGenomes,KEGG）分析
• 2.5 芥菜型油菜黄籽亲本及其褐籽近等基因系种皮转录本表达差异分析
• 2.6 芥菜型油菜黄籽亲本及其褐籽近等基因系种皮类黄酮合成途径unigenes表达比较
• 2.7 芥菜型油菜黄、褐籽种皮中差异表达的基因的（qRT-RCR）验证
• 3 讨论
• 第五章 总结和下一步计划
• 参考文献
• 附录Ⅰ 芥菜型油菜A09染色体黄籽基因区域BAC重叠群部分BAC的末端序列与白菜基因组序列比对
• 附录Ⅱ 芥菜型油菜全长测序BAC的序列数据统计
• 附录Ⅲ 芥菜型油菜A09染色体黄籽基因区域的预测基因列表
• 附录Ⅳ 芥菜型油菜BjuA.TT8和BjuB.TT8基因启动子作用元件表
• 附录Ⅴ 芥菜型油菜Bju.TT8基因的cDNA序列
• 附录Ⅵ 芥菜型油菜种皮unigenes所属KEGG途径和相应unigenes数目统计
• 附录Ⅶ 芥菜型油菜黄褐籽种皮差异表达的unigenes及其差异倍数
• 附录Ⅷ 芥菜型油菜四川黄籽与其褐籽近等基因系NILA种皮类黄酮生物合成途径unigenes表达比较
• 附录Ⅸ 缩写词
• 致谢
• 作者简历