论文摘要
研究背景目前对肿瘤发病机制的研究主要集中在肿瘤相关蛋白基因的克隆和功能分析、细胞信号转导通路及细胞周期调控等三大领域。细胞信号传导通路与肿瘤的发生、发展密切相关。JAK激酶/信号转导和转录激活因子（Janus Kinase/Signal and activators of transcription,JAK/STAT）通路是目前研究较多的细胞信号传导通路之一。JAK/STAT通路活化影响细胞的生长、增殖、凋亡及促进细胞周期等,参与肿瘤的发生、发展。另外,研究表明JAK/STAT通路活化可以上调Bcl-2蛋白表达,增强细胞的抗凋亡能力。因此,阻断该传导通路成为肿瘤治疗的新靶点。AG490是目前研究较深入的JAK/STAT信号传导通路抑制剂,通过阻断其信号的转导过程,能够显著抑制肿瘤细胞的生长,诱导肿瘤细胞的凋亡,并参与调节人体免疫反应、炎症反应等,是目前研究的焦点。多烯紫杉醇（Docetaxel,DT）是迄今为止第一个也是唯一一个被证明对激素非依赖性前列腺癌患者具有明确生存益处的化疗药物。多烯紫杉醇是一种半合成的紫杉醇类衍生物,与紫杉醇相比有更强的微管蛋白亲和力和更长的细胞内停留时间（是紫杉醇的2-12倍）,因此对肿瘤细胞的破坏力更强。它抗肿瘤的主要机制是通过促进细胞微管聚合,阻止微管正常的生理解聚,将细胞周期阻滞于G2/M期,影响细胞有丝分裂过程,从而导致癌细胞的死亡,产生抗肿瘤作用。目前研究发现多烯紫杉醇还有抑制Bcl-2和Bcl-XL基因表达的作用。Bcl-2是目前研究较广泛深入的抗凋亡基因,与前列腺癌的发生、发展及预后密切相关,已成为近年来研究的热点。目前,前列腺癌具体的发病机制尚不清楚,国内外的许多专家学者对前列腺癌的细胞学开展了广泛的研究。近年来有三种前列腺癌细胞株已广泛的应用于人前列腺癌的研究领域,在这三种细胞株（LNCaP、DU-145和PC-3）中,LNCaP是雄激素依赖性前列腺癌细胞株,DU- 145和PC-3是雄激素非依赖性前列腺癌细胞株。事实上,前列腺癌患者在确诊时,大部分已经发生了局部进展和远处转移,从而失去了根治性手术治疗的机会,只能采用阻断雄激素的内分泌治疗方法,但临床上大多数患者经过抗雄激素治疗后,会逐渐由雄激素依赖型前列腺癌转变为雄激素非依赖型的前列腺癌,转变后的前列腺癌对内分泌治疗的敏感性也就随之降低,治疗效果往往不理想。上述情况表明,针对如何延缓雄激素依赖型前列腺癌向雄激素非依赖型前列腺癌的转变,以及探寻雄激素非依赖型前列腺癌转变的机制及更加有效的治疗方法,目前已经成为前列腺癌研究的焦点课题。目的本实验旨在探讨多烯紫杉醇和AG490联合用药对人前列腺癌DU-145细胞增殖的影响及其可能的机制,寻求对激素难治性前列腺癌更为有效的治疗方法。方法1.培养人前列腺癌DU-145细胞株,观察细胞生长情况并摄片。2.本实验分为单一用药实验和联合用药实验两部分,单一用药实验设不同浓度的AG490组、多烯紫杉醇组和空白对照组,细胞形态学观察单独用药对DU-145细胞增殖抑制及诱导凋亡作用,通过四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法观察AG490对细胞增殖活力的影响,计算细胞生长抑制率和AG490的半数抑制浓度IC50。3.选择抑制率在10%-40%的多烯紫杉醇和AG490浓度作为联合用药的浓度,两种药物联用,MTT法分别测定各实验组对DU-145细胞的抑制作用。4.采用流式细胞仪（FCM）定量检测终浓度为20μmol/L、40μmol/L、80μmol/L的AG490及40μmol/L AG490联合100nmol/L多烯紫杉醇作用DU-145细胞48小时,各组对DU-145细胞周期分布的影响。5.通过免疫细胞化学方法检测各组药物作用后,DU-145细胞Bcl-2蛋白表达水平。6.用SPSS16.0软件对结果进行统计学分析。结果1.通过对细胞形态学观察证实中国科学院细胞库提供的细胞确实为人前列腺癌DU-145细胞。2.JAK激酶抑制剂AG490处理DU-145细胞后,细胞凋亡明显增多,细胞缩小变圆,细胞膜出泡等。3.单独用药实验结果显示,AG490及多烯紫杉醇均对人前列腺癌DU-145细胞具有抑制增殖及诱导凋亡的作用,并有浓度-时间效应。联合用药实验结果显示,AG490能明显增强低浓度多烯紫杉醇对人前列腺癌DU-145细胞的抑制增殖及诱导凋亡的作用,明显高于单一用药方案（P<0.05）。4.流式细胞仪检测细胞周期分析表明,AG490处理组G1期细胞比例有所增加,S期细胞比例明显降低。多烯紫杉醇导致的细胞周期阻滞则以G2/M期为主,AG490联合多烯紫杉醇处理组G1期细胞比例和S期细胞比例介于AG490处理组和多烯紫杉醇处理组之间。5.免疫细胞化学实验结果显示,实验组各组和对照组比较, DU-145细胞Bcl-2蛋白表达明显下调,差别有统计学意义（P<0.05）。结论1.JAK激酶抑制剂AG490使凋亡细胞明显增多,并以时间和浓度依赖性抑制DU-145细胞的增殖,改变细胞周期分布、促进细胞凋亡。2.JAK激酶抑制剂AG490通过抑制JAK/STAT信号途径而下调Bcl-2蛋白的表达来抑制DU-145细胞的增殖,促进细胞凋亡。3.AG490能明显增强低浓度多烯紫杉醇对DU-145细胞的增殖抑制作用,两者具有协同作用,其协同抗前列腺癌的作用可能是通过共同下调DU-145细胞的Bcl-2蛋白水平来实现的。我们认为AG490可作为治疗激素难治性前列腺癌的可选择药物之一,联合应用多烯紫杉醇和AG490可望成为有效治疗激素难治性前列腺癌的新方案。