玉米根系蛋白磷酸酶ZmPP2C2基因的分离、功能鉴定及转基因烟草对逆境胁迫的响应

论文摘要

非生物胁迫是影响植物生长发育和产量的重要环境因素,而其中又以干旱、低温和盐渍的影响最为严重。植物在长期的进化过程中形成了一套主动的防御机制,能够识别逆境信息并通过信号传递最终调节植物的生长发育,从而抵御不良环境的影响。大量研究表明,在逆境条件下植物体内积累渗透调节物质如脯氨酸、可溶性糖、甜菜碱等,同时,许多基因被诱导表达。植物体内存在复杂的信号传递途径,由蛋白激酶和蛋白磷酸酶催化的蛋白质可逆磷酸化过程是细胞信号转导的重要组成部分,是细胞内重要的调节机制,广泛参与植物的生长、发育、增殖、分化等。蛋白质的可逆磷酸化反应对于信号的快速、精确传递起着无可替代的作用。蛋白磷酸酶,通过逆转蛋白激酶的作用,调节可逆磷酸化过程。生物化学和分子遗传学研究表明,PP2C广泛参与逆境信号的传递过程,可能在许多信号转导途径中作为负调控因子,在调节由环境胁迫如冷害、干旱、损伤等激活的信号通路中起作用。但关于逆境信号传递途径的研究还很有限,PP2C参与逆境信号途径的具体机制尚不清楚。本研究从玉米根系中分离到PP2C类蛋白磷酸酶基因ZmPP2C2,并对该基因的表达特性和功能进行了分析。结果表明,该基因在根、茎、叶和种子中都有表达,在种子表达高;不同逆境胁迫及信号分子处理后ZmPP2C2的表达有所不同,ZmPP2C2在转录水平和翻译水平响应低温逆境;过量表达该基因可提高转基因烟草植株对干旱、低温和盐渍的抗性。主要结果如下:1.利用同源序列设计简并引物,通过RT-PCR的方法从玉米根系中克隆到PP2C类蛋白磷酸酶基因的中间片段,通过5’-RACE和3’-RACE分别克隆到5’和3’片段,拼接后设计特异引物扩增到全长cDNA。命名为ZmPP2C2 （GenBank注册号:AY830123）。该基因全长为1399 bp,ORF为855 bp,编码284个氨基酸,分子量约为30.9 kDa。同源序列比较发现,ZmPP2C2的序列与拟南芥、水稻、苜蓿、玉米的ZmPP2C类基因的序列同源性较高。结构同源性分析表明,ZmPP2C2有11个序列保守的结构域和6个保守的参与金属离子与磷酸基团相互作用的氨基酸。跨膜结构分析表明,ZmPP2C是一个亲水蛋白,存在一个明显的内向超螺旋结构和两个潜在的外向超螺旋。2、Southern杂交结果显示,ZmPP2C2在玉米基因组中以单拷贝形式存在。Northern杂交结果表明ZmPP2C2在根、茎、叶、种子中均有表达,在种子中表达量高。低温、PEG、NaCl、ABA均能诱导ZmPP2C2的表达,并且Ca2+在ABA诱导的ZmPP2C2表达过程中起负调控作用。ZmPP2C2在转录和翻译水平都表现出对低温逆境的响应,表达量随时间变化有所不同。3、将pBI121-ZmPP2C2-GFP融合蛋白在洋葱表皮细胞表达。在荧光显微镜下观察到细胞核内有GFP激发的绿色荧光,说明ZmPP2C2的基因产物定位于细胞核。系统进化树分析表明,ZmPP2C2蛋白与拟南芥、苜蓿中的PP2C蛋白高度同源。4、构建了原核表达载体pET-ZmPP2C2,并在大肠杆菌BL21中表达融合蛋白,诱导纯化后免疫小白鼠,制备抗体。Western杂交表明,转基因植株中ZmPP2C2基因已在蛋白水平过量表达。5、构建pBI-ZmPP2C2正义表达载体,利用农杆菌介导的叶盘法转化烟草。用PCR、Northern杂交及Western杂交的方法,对带卡那抗性的转基因烟草植株进一步检测,结果证明成功地获得了超表达ZmPP2C2基因的转基因烟草植株。6、在逆境胁迫（低温、高盐、干旱）处理条件下,过量表达ZmPP2C2基因的转基因烟草种子比野生型烟草种子萌发率高。7、盐渍、干旱处理过程中野生型和转基因烟草叶片的净光合速率（Pn）都呈下降趋势,但野生型的降低较明显。胁迫对两种类型烟草叶片的细胞间隙CO2浓度（Ci）和气孔导度（Gs）的影响无明显差异。盐胁迫下,转基因烟草Fv/Fm降幅较小,PSⅡ受伤害较轻。8、逆境胁迫（低温、高盐、干旱）下,两种类型烟草叶片的相对电导率、MDA的含量都呈上升趋势,膜透性增大,电解质外渗量增多,膜脂过氧化作用增强。但转基因烟草相对电导率和MDA含量较野生型烟草低,说明转基因烟草膜脂过氧化程度低于野生型烟草,膜伤害程度较轻。9、在低温胁迫下,两种类型烟草叶片的SOD、CAT活性都呈上升趋势,而POD活性呈先升高后降低的趋势;在高盐胁迫下,两种类型烟草叶片的SOD活性呈先升高后降低的趋势,而POD、CAT活性都呈上升趋势;在干旱胁迫下,野生型和转基因烟草叶片的SOD、POD、CAT活性都呈现先升高后降低的趋势;但在三种胁迫下转基因烟草SOD、POD、CAT活性始终高于野生型烟草。10、逆境胁迫（低温、高盐、干旱）下,转基因烟草相容性物质脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白的积累明显高于野生型烟草。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 英文缩写符号及中英文对照表
• 1 前言
• 1.1 细胞信号转导
• 1.1.1 细胞信号及其种类
• 1.2 植物细胞信号转导
• 1.2.1 环境信号的胞间传递
• 1.2.2 环境信号的跨膜转换
• 1.2.3 第二信使产生和传输过程
• 1.2.4 蛋白质的可逆磷酸化
• 1.3 蛋白磷酸酶
• 1.3.1 蛋白磷酸酶的发现
• 1.3.2 植物蛋白磷酸酶的分类
• 1.3.3 植物中PP2C 的生化特性与蛋白质结构
• 1.3.4 PP2C 的进化
• 1.3.5 植物细胞内PP2C 的调控
• 1.3.6 植物中PP2C 的功能
• 1.4 本课题的研究目的及意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 植物材料培养与处理
• 2.1.3 菌株与质粒
• 2.1.4 酶及生化试剂
• 2.1.5 PCR 引物
• 2.1.6 培养基
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 植物材料总RNA 的提取
• 2.2.2 cDNA 第一条链的合成
• 2.2.3 cDNA 纯化（用于5’RACE）
• 2.2.4 对cDNA 进行末端加尾（用于5’RACE）
• 2.2.5 玉米根系蛋白磷酸酶ZmPP2C2 基因全长的克隆
• 2.2.6 连接反应
• 2.2.7 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化
• 2.2.8 碱法小量提取质粒DNA
• 2.2.9 质粒DNA 的酶切鉴定
• 2.2.10 DNA 序列测定
• 2.2.11 Northern 杂交分析
• 2.2.12 Southern 杂交分析
• 2.2.13 农杆菌介导的遗传转化（如图2－1 所示）
• 2.2.14 农杆菌介导的烟草转化
• 2.2.15 转基因植株的PCR 检测
• 2.2.16 ZmPP2C2 的原核表达及抗体制备
• 2.2.17 Western blot 检测蛋白表达
• 2.2.18 洋葱表皮亚细胞定位
• 2.2.19 烟草种子萌发实验
• 2.2.20 转基因烟草植株生理指标测定
• 3. 结果与分析
• 3.1 玉米根系蛋白磷酸酶ZmPP2C2 基因的分离
• 3.1.1 ZmPP2C2 中间片段的分离
• 3.1.2 ZmPP2C2 5’片段的分离
• 3.1.3 ZmPP2C2 3’片段的分离
• 3.1.4 ZmPP2C2 全长cDNA 的分离
• 3.2 ZmPP2C2 基因的序列分析
• 3.3 ZmPP2C2-GFP 融合蛋白的亚细胞定位
• 3.4 ZmPP2C2 基因在大肠杆菌中的表达、抗体制备及效价测定
• 3.4.1 原核表达载体pET30a-ZmPP2C2 的构建
• 3.4.2 重组蛋白SDS-PAGE 分析
• 3.4.3 pET30a-Zm PP2C2 重组蛋白亲和纯化及抗血清效价测定
• 3.5 ZmPP2C2 基因在玉米中的表达分析
• 3.5.1 ZmPP2C2 在玉米基因组中的拷贝数分析
• 3.5.2 ZmPP2C2 基因在玉米不同器官的表达
• 3.5.3 ZmPP2C2 基因对信号物质和逆境胁迫的应答
• 3.5.4 ZmPP2C2 基因对低温胁迫的时间响应
• 3.6 ZmPP2C2 基因在烟草中的转化
• 3.6.1 转基因烟草正义表达载体的构建
• 3.6.2 转基因烟草植株的鉴定
• 3.7 ZmPP2C2 的过表达增强转基因烟草对低温胁迫的抗性
• 3.7.1 ZmPP2C2 的过表达对低温胁迫下烟草种子萌发的影响
• 3.7.2 ZmPP2C2 过表达对低温胁迫下转基因烟草相对电导率及MDA 含量的影响
• 3.7.3 ZmPP2C2 过表达对低温胁迫下转基因烟草抗氧化酶系统活性的影响
• 3.7.4 ZmPP2C2 过表达对低温胁迫下转基因烟草脯氨酸和可溶性糖含量的影响
• 3.8 ZmPP2C2 的过表达增强转基因烟草对盐胁迫的抗性
• 3.8.1 ZmPP2C2 过表达对盐胁迫下烟草种子萌发的影响
• 3.8.2 ZmPP2C2 过表达对盐胁迫下转基因烟草叶片气体交换参数的影响
• 3.8.3 ZmPP2C2 过表达对盐胁迫下转基因烟草叶片荧光参数的影响
• 3.8.4 ZmPP2C2 过表达对盐胁迫下转基因烟草相对电导率及 MDA 含量的影响
• 3.8.5 ZmPP2C2 过表达对盐胁迫下转基因烟草抗氧化酶系统活性的影响
• 3.8.6 ZmPP2C2 过表达对盐胁迫下转基因烟草脯氨酸和可溶性糖含量的影响
• 3.8.7 ZmPP2C2 过表达对盐胁迫下转基因烟草可溶性蛋白的影响
• 3.9 ZmPP2C2 的过表达增强转基因烟草对干旱胁迫的抗性
• 3.9.1 ZmPP2C2 的过表达对水分胁迫下烟草种子萌发的影响
• 3.9.2 ZmPP2C2 过表达对水分胁迫下转基因烟草气体交换参数的影响
• 3.9.3 ZmPP2C2 过表达对水分胁迫下转基因烟草相对电导率及MDA 含量的影响
• 3.9.4 ZmPP2C2 过表达对水分胁迫下转基因烟草抗氧化酶系统活性的影响
• 3.9.5 ZmPP2C2 过表达对水分胁迫下转基因烟草脯氨酸和可溶性糖含量的影响
• 3.9.6 ZmPP2C2 过表达对水分胁迫下转基因烟草可溶性蛋白的影响
• 4 讨论
• 4.1 ZmPP2C2 编码PP2C 类蛋白磷酸酶
• 4.2 信号物质及逆境胁迫对ZmPP2C2 基因的表达调控
• 4.3 ZmPP2C2 过表达提高了转基因烟草对低温、盐渍和干旱逆境的抗性
• 5 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的论文