Jak2信号缺陷可选择性抑制DC而对LPS所致内毒素性休克产生保护

论文摘要

一、研究背景内毒素性休克临床特征表现为严重的毒血症，伴低血压和器官低灌注，且对液体复苏反应欠佳，是ICU中致死的最常见病因之一，死亡率高达20%～80％，仅在美国每年超过10万名患者死于该症。目前认为，固有免疫应答过强是导致内毒素性休克早期死亡的主要原因，而适应性免疫应答被抑制，成为患者晚期死亡的重要原因。DC属固有免疫细胞，其通过摄取抗原、分泌促炎性因子等参与固有免疫应答。同时，DC作为体内最重要的抗原提呈细胞（APC），也是介导适应性免疫应答的关键细胞，其机制为：①加工、处理、提呈外源性抗原，提供T细胞活化的第一信号；②激活的DC高表达共刺激分子，提供T细胞活化所需的第二信号；③产生多种细胞因子，辅助淋巴细胞活化。因而，以DC为代表的APC被认为是连接固有免疫和适应性免疫的桥梁。鉴于DC在固有免疫和适应性免疫中发挥的关键作用，被视为探讨内毒素性休克机制和探索相关干预策略的重要靶标。Jak2是janus激酶家族的重要成员，其参与细胞存活、增殖、分化和凋亡信号转导。已发现，Jak2在调控DC发育和功能中发挥重要作用。由于Jak2基因缺陷可导致胚胎期死亡，目前多使用Jak2抑制剂（如AG490）开展Jak2相关的研究，但化学抑制剂难以避免非特异性作用，且不同抑制剂所介导的效应可能各异，故对Jak2调控DC功能的作用及机制仍存在很大争议。据此，本研究建立诱导性Jak2基因敲除小鼠模型，并获如下发现：①Jak2基因缺陷可抑制DC的固有免疫功能，表现为发育受阻，低表达MHC分子和共刺激分子，且在LPS刺激下分泌细胞因子的能力下降；②Jak2基因缺陷并不影响DC介导适应性免疫应答的能力；③Jak2基因敲除小鼠对LPS所致的内毒素性休克有很强抵抗作用。二、诱导性Jak2基因敲除小鼠模型的建立及功能分析1．Cre+／+Jak2fl/fl小鼠模型建立本文用Jak2fl/fl小鼠和他莫昔芬诱导性Cre转基因小鼠进行杂交，成功复制诱导性Jak2基因敲除小鼠(Cre+/+Jak2fl/fl)模型。对8周龄雄性Cre+/+Jak2fl/fl小鼠腹腔注射他莫昔芬（1．0mg／40g体重）／次，每天一次，连续5天，注射溶剂（含10％乙醇的玉米油）的同窝雄性小鼠作为对照。最后一次注射2周后处死小鼠，培养BMDC和脾细胞，提取蛋白，借助Western blot分析Jak2表达，以验证基因敲除效果。结果显示；对照小鼠BMDC高表达Jak2，而他莫昔芬诱导的小鼠DC中未检出Jak2，脾细胞也获类似结果，表明在他莫昔芬诱导后，Cre+/+Jak2fl/fl小鼠Jak2表达缺失。2．Jak2基因敲除小鼠DC功能的改变（1）Jak2基因缺陷抑制DC发育：采集Jak2-/-小鼠和对照小鼠骨髓细胞，用GM-CSF和IL-4诱导分化为BMDC。结果证实（与对照组相比）：①Jak2基因缺陷组BMDC数量降低1．3倍；②Jak2基因缺陷组脾细胞总数明显降低，脾脏DC数量及在脾细胞中所占比例均降低；③Jak2基因缺陷组CD4+和CD8+T细胞百分比未见明显变化。上述结果表明：Jak2功能缺陷可明显影响DC发育。（2）Jak2基因缺陷抑制DC成熟和分泌细胞因子：培养第9天取部分DC，用LPS（500ng/ml）刺激24小时，于第10天收集DC，流式细胞术分析表型。结果显示：①Jak2基因敲除组和对照组DC纯度均大于85％；②Jak2基因敲除组B MDC表面MHCⅡ类分子和共刺激分子（CD80、CD86和CD54）表达均明显下降；③对单个脾DC检测，所得结果与BMDC相似；④Jak2基因敲除组巨噬细胞表型改变类似于DC。上述结果提示：Jak2基因缺陷可抑制DC成熟。进一步检测Jak2缺陷对DC功能的影响。采集BMDC培养上清，借助ELISA检测相关细胞因子分泌：①LPS刺激前，Jak2-/-和对照BMDC上清中均未能检出IL-2、IL-6、IL-10和IL-12，Jak2-/-组可检出低水平TNF-α（约为野生型的1／5）；②LPS刺激后，对照检查组BMDC分泌大量促炎性细胞因子（TNF-α、IL-6和IL-12），而Jak2-/-BMDC所分泌相应细胞因子水平明显低于对照组；③LPS刺激后，Jak2-/-和野生型BMDC均未检出IL-2和IL-10。上述结果显示：Jak2基因缺陷可明显抑制DC分泌炎性细胞因子。（3）Jak2缺陷不影响DC启动适应性免疫应答：借助同种异体混合淋巴细胞培养检测DC刺激T细胞增殖的能力。经射线照射的Jak2-/-和野生型BMDC与BALB／c小鼠T细胞共培养，用3H标记的胸腺嘧啶掺入实验检测T细胞增殖。结果发现：Jak2-/-和野生型BMDC刺激同种异体BALB／c小鼠T细胞增殖的能力相似。进一步将5只Jak2-/-或野生型小鼠脾脏细胞混合，经阴性选择分离和纯化脾脏DC并用2000Rad射线照射，将脾脏DC与BALB／c小鼠T细胞共培养。结果发现，Jak2-/-和野生型脾脏DC刺激T细胞增殖的作用无明显差异。将照射后的Jak2-/-和野生型BMDC或脾脏DC加载1μM OVA多肽，与OT-1转基因小鼠T细胞共孵育56小时，加入3H标记的胸腺嘧啶培养18小时。结果发现：Jak2-/-和野生型BMDC或脾脏DC刺激抗原特异性T细胞增殖的能力相似。文献已报道，耐受性DC也可刺激T细胞增殖，但均为失能T细胞，不能产生细胞因子和清除病原体。为此，借助ELISA方法分析Jak2-/-DC刺激后T细胞的细胞因子分泌谱。结果发现：Jak2-/-DC能刺激T细胞分泌IFN-γ、IL-10和IL-17，其分泌水平与野生型DC刺激T细胞分泌的水平无显著差异。上述结果显示，Jak2缺陷仅选择性抑制DC的固有免疫功能，但不影响DC介导适应性免疫应答的功能。三、Jak2缺陷对致死性内毒素性休克的保护作用内毒素性休克属经典的炎性疾病，固有免疫异常在发病中起关键性作用。为探讨Jak2调控固有免疫的效应，本文复制内毒素性休克模型，方法为：给予他莫昔芬4周，注射致死剂量LPS至Jak2基因敲除和野生型小鼠腹腔内。LPS注射数小时后发现野生型小鼠的一般状态明显比Jak2基因敲除小鼠差，表现为发抖，蜷缩于鼠笼一角。两组小鼠内毒素性休克存活率分别为22%和85%。已证实，过强的固有免疫应答产生大量炎性细胞因子（尤其TNF-α），在内毒素性休克死亡中起关键作用。腹腔注射非致死剂量LPS 12小时后采集血清，借助ELISA方法定量检测血清细胞因子，结果发现：Jak2基因缺陷鼠血清TNF-α、IL-6和IL-12水平显著低于野生型小鼠，而IL-2水平则高于对照小鼠（尽管两组IL-2水平均不高）。DC数量减少和功能缺陷是毒血症晚期死亡的重要原因之一。本文用LPS（10μg／ml）处理Jak2-／-和野生型BMDC，96小时进行Annexin-V和PI双染，流式细胞术检测DC凋亡，结果发现基因敲除组和对照组无明显差异。另外，给Jak2-／-和野生型小鼠腹腔注射LPS（150gμg），20小时后处死，取脾脏细胞检测凋亡，结果与BMDC类似，．Jak2基因敲除不影响LPS刺激后DC凋亡。四、Jak2调控DC功能的相关信号通路1．Jak2缺失抑制STAT4、STAT45、STAT46活化Jak2可激活众多STAT分子而启动不同下游效应。本文用LPS（1μg／ml）刺激Jak2缺陷型和野生型BMDC（2×106/ml），30分钟后用100μl裂解液RIPA（含1x蛋白酶抑制剂和1x磷酸酶抑制剂）裂解BMDC，借助Western blot技术检测下游信号分子的活化。结果显示：Jak2缺陷型BMDC裂解产物中，STAT4、STAT5和STAT6磷酸化水平降低，而STAT1活化水平无明显改变，裂解液中未检出活化形式的STAT3。鉴于NF-κB是LPS的主要信号通路，我们检测两组DC在LPS刺激后的磷酸化IκB-α及NF-κB水平。结果发现：LPS刺激30分钟后，两组间磷酸化的IκB-α和总NF-κB水平无明显差异。2．Jak2-STAT5通路促进DC发育和成熟应用STAT5转基因小鼠模型探讨STAT5信号通路参与固有免疫应答的效应：①分离STAT5转基因小鼠脾脏细胞和骨髓细胞，诱导BMDC生成，Western检测发现转基因小鼠STAT5表达明显高于对照小鼠；②STAT5转基因阳性小鼠脾脏细胞数量明显高于转基因阴性的同窝对照小鼠和野生型对照小鼠；③流式细胞术检测发现，STAT5过表达小鼠脾脏细胞中DC比例上调；④应用GM-CSF和IL-4诱导STAT5转基因小鼠和对照小鼠骨髓细胞分化为DC，STAT5过表达可增加BMDC数量；⑤在刺激或未刺激条件下，STAT5过表达BMDC中MHCⅡ阳性细胞群、CD80阳性细胞群、CD86阳性细胞群和CD54阳性细胞群比例均显著上调；⑥LPS刺激前后，STAT5转基因BMDC分泌TNF-α和IL-6水平与对照BMDC无显著区别；⑦LPS刺激后，STAT5过表达BMDC分泌IL-12水平比对照BMDC明显升高。上述结果表明，Jak2功能丧失可通过下调STAT5而抑制DC发育、成熟。3．Jak2-STAT6通路调节DC分泌炎性细胞因子鉴于STAT5仅影响DC分泌IL-12，提示可能存在其他通路影响LPS刺激后DC分泌炎性细胞因子。采集STAT4基因敲除小鼠、STAT6基因敲除小鼠和野生型对照小鼠骨髓细胞，诱导生成BMDC，第9天用LPS（0．5μg／ml）刺激BMDC（2．5×106／ml），24小时后采集培养上清，ELISA检测促炎性细胞因子分泌，结果发现：（1）未受LPS刺激，STAT6-／-BMDC分泌IL-6和TNF-α水平明显高于野生型对照组；各组BMDC均未检出IL-12。由此提示：STAT6基因缺陷可降低BMDC对LPS的反应性。（2）LPS刺激24小时后，STAT6-／-BMDC分泌TNF-α和IL-12均明显低于对照组，IL-6水平与对照组无明显差异。考虑到刺激前基础分泌水平，LPS刺激促进DC分泌炎性因子的效应在STAT6缺陷组明显低于其他组。LPS刺激后，野生型BMDC分泌IL-6和TNF-α水平分别升高40倍和244倍，而STAT6缺陷BMDC仅分别升高6．5和1 2．9倍。（3）STAT4基因缺陷并不影响DC分泌炎性因子（尽管刺激前基础分泌水平较高），LPS刺激后，STAT4-／-BMDC分泌TNF-α升高倍数低于对照BMDC。LPS刺激后，TAT4-／-BMDC分泌3种炎性细胞因子的水平与野生型对照无明显差异。以上结果提示：Jak2缺失可通过STAT6途径而影响DC分泌炎性细胞因子。五、结论1．Jak2基因敲除可抑制DC发育、成熟和分泌细胞因子。2．Jak2基因缺陷不影响DC引发适应性免疫应答的功能。3．Jak2基因敲除小鼠对致死剂量LPS所致内毒素性休克有抵抗作用，此效应与抑制DC分泌炎性因子相关。4．Jak2缺陷可影响STAT4、5、6活化；Jak2／STAT5信号通路参与调控DC发育、成熟；Jak2／STAT6通路参与调控DC分泌细胞因子。综上所述，Jak2通过STAT5途径调节DC发育和成熟，通过STAT6信号通路调控促炎性细胞因子分泌。DC的Jak2信号缺失可抑制其固有免疫功能，但不影响DC参与适应性免疫应答的功能。提示阻断DC的Jak2信号通路可能作为临床干预内毒素性休克的靶标。

论文目录

主要缩略词表

中文摘要

英文摘要

前言

第一部分 Jak2信号缺失可选择性抑制DC而对LPS所致内毒素性休克产生保护

实验材料

实验方法

实验结果

小结

第二部分 Jak2信号缺失对LPS所致内毒素性休克保护作用的机制