Ⅱ型mGluR激动剂改善MK-801诱导的前额叶NMDA受体功能紊乱的实验研究

论文摘要

第一部分:NMDA受体在大脑前额叶皮层中间神经元的表达目的:前额叶皮层由多种具有不同形态学特征及功能的细胞种类组成,其中抑制性γ-氨基丁酸系统包括各种类型的中间神经元,这些神经元包含不同的钙结合蛋白,比如小白蛋白（parvalbumin）。之前研究提示包含parvalbumin的神经元在精神分裂症中呈现选择性损害,而这种特异性改变为研究该疾病的分子生物学机制带来极大的挑战。现阶段的在体分子生物学研究仍旧停留在组织学水平,可以得到基因宏观改变的信息,但是无法获知其在特定细胞种属的改变。因此揭示精神分裂症的病理机制迫切需要一种能够选择性研究某类特定细胞类型的方法。激光显微切割细胞技术作为一种全新的飞跃,可以在显微镜直视下获取特定大脑皮层的特定细胞种属,而实时定量多聚酶链式反应（polymerase chainreaction,PCR）是当前最流行的定量基因拷贝数的分子生物学技术,两者的结合使研究包含parvalbumin的神经元的基因表达成为可能。虽然包含parvalbumin的中间神经元对NMDA受体拮抗剂极为敏感,但是这类细胞是否能够表达NMDA受体的亚单位还未可知。根据其对内源性和外源性配体的敏感性、对离子的通透性、合成酶的特性以及与细胞内蛋白的联系,可以将NMDA受体分为以下不同的亚单位,即NR1和NR2亚单位,后者包括NR2A、NR2B、NR2C和NR2D,以及NR3亚单位。为探讨中间神经元的可能的分子特性,我们设计了联合性的实验方法—激光显微切割细胞技术、anti-sense RNA的扩增和实时定量PCR,然后检测了NMDA受体亚单位在这类细胞和前额叶皮层组织中的表达并进行对比。方法:1.NovaRed快速染色2.激光显微切割细胞技术3.RNA提取4.逆转录polymerase chain reaction（PCR） 5.anti-sense RNA的扩增6.实时定量PCR 7.免疫荧光染色8.蛋白定量技术western blotting结果:PV阳性中间神经元的NMDA受体亚单位组成显著不同于前额叶皮层组织。逆转录PCR检测提示所有NMDA受体基因引物都具有高敏感性和特异性。分离自前额叶组织和PV阳性的中间神经元的RNA质量经检测具有符合实验标准,其260/280比值为1.982±0.016,完整性指数8.63±0.16,28s/18s的比值,1.90±0.15;18s与基线的比值,7.23±1.17,提示来自激光显微切割细胞的RNA未被降解和污染。前额叶皮层组织表达NR1亚单位和所有的NR2亚单位,相对于内参基因的各亚单位的水平为:NR1,7.76±1.78;NR2A,1.92±0.66;NR2B,31.7±3.91;NR2C,1.89±0.45;NR2D,1.52±0.41。对比显示前额叶表达较高的NR2B亚单位,其水平远远高于NR2A（p=0.0001）。免疫荧光染色提示占前额叶70%NMDA受体的锥体细胞表达显著高于NR2A（4.57±0.23）的NR2B水平（8.19±0.41）。但是,PV阳性的中间神经元仅表达NR1亚单位和NR2A、NR2B、NR2C,而不表达NR2D亚单位,各亚单位的水平为:NR1,35.7±11.4;NR2A,77.1±28.3;NR2B,10.7±4.26;NR2C,27.3±3.62。相对于NR2A,PV阳性的中间神经元表达较低水平的NR2B（p=0.031）,免疫荧光染色也证实了这个结论（NR2A,5.33±0.27;NR2B,4.07±0.64）。所有结果表明PV阳性中间神经元的NR2A/NR2B比值远远高于前额叶（p＜0.01）。结论:通过以上实验,我们成功地建立了一种联合性方法-NovaRed快速染色、激光显微切割细胞技术联合实时定量PCR,这种结合使检测前额叶PV阳性的中间神经元中MDA受体亚单位的表达成为可能,代表了在体基因检测从组织水平成功前进至单个细胞水平。此外,我们发现NMDA亚单位中的NR1,NR2A,NR2B,NR2C表达于PV阳性的中间神经元中,但是并未发现能表达于前额叶中的NR2D亚单位,而且这类细胞表达显著不同于前额叶皮层组织的NR2A/NR2B比值,提示中间神经元的特殊生理特性。第二部分:MK-801对NMDA受体在前额叶中间神经元表达的不同影响及其作用机制目的:基于非竞争性NMDA受体阻断剂,如MK-801可以导致与精神分裂症疾病相类似的组织学和行为的异常,“NMDA功能低下假说”逐渐取代了多巴胺假说在精神分裂症发病机制中的地位,而且这类药物也被大量应用于精神分裂症的动物模型研究。但是与这种假说相矛盾的是,无论对临床病人或者动物模型前额叶皮层的NMDA受体的检测均提示其水平的改变大相径庭,甚至截然相反,包括升高、不变或者降低,而且直接针对NMDA受体的药物并没有显著改善精神分裂症的症状。离体研究表明,与锥体细胞相比,PV阳性的中间神经元具有对NMDA受体阻断剂更高的敏感性,而且这类神经元在精神分裂症中被选择性损伤。至今为止在细胞层次关于该疾病病理机制的主张为PV阳性的中间神经元作为NMDA受体的感受器发挥功能,应用NMDA受体阻断剂之后,此类神经元的NMDA通道被抑制而致其兴奋性降低,释放抑制性神经递质减少,反馈性引起锥体细胞兴奋性升高,而这种长时间兴奋可以引起细胞水肿或其他征象,致兴奋性回落甚至降低,但是这种主张尚未得到直接证明。基于上述兴奋性毒性作用引起的细胞特性的改变,我们考虑NMDA受体在动物模型中的不同改变和所应用的受体阻断剂的剂量密切相关,而且不同剂量对受体水平的影响趋势可能完全相反,但是尚未出现有关研究。此外,精神分裂症中PV阳性中间神经元的受体各亚单位mRNA和蛋白水平是如何受到影响的?这种改变是否和前额叶皮层保持一致?这些问题尚不清楚。所以我们对各组动物进行不同剂量的MK-801亚慢性处理（5天）,然后检测NMDA受体在不同组动物的前额叶PV阳性中间神经元和前额叶皮层组织的表达并进行对比,进而探讨精神分裂症细胞水平的病理机制。方法:1.不同剂量的MK-801治疗成年雌性大鼠5天2.联合性方法检测NMDA受体在parvalbumin细胞的表达3.免疫荧光染色4.Western blotting蛋白质定量技术结果:MK-801诱导的PV阳性中间神经元NMDA受体亚单位的改变显著不同于前额叶皮层组织。通过比较MK-801处理组和对照组动物NMDA受体表达水平得到,随着MK-801剂量的升高,前额叶皮层组织中NMDA受体亚单位的表达水平呈现倒置的“U”形曲线,在低剂量的时候表达增加,而在高剂量的时候表达减少,虽然各种亚单位之间的变化存在或多或少的差异。从0.01mg/kg到0.1mg/kg剂量的MK-801处理显著提高NMDA受体的水平,具体表现为:NR1亚单位升高了1.6-2.0倍,NR2A升高了2.3-3.9倍,NR2B升高了1.8-2.5倍,NR2C升高了1.6-3.5倍,NR2D升高了1.9-3.8倍（p＜0.05）,0.33 mg/kg的MK-801处理没有引起显著改变,而1.0mg/kg的MK-801处理则显著降低NMDA受体的水平,虽然NR2D升高了1.9倍,但是没有显著统计学意义（p=0.149）。PV阳性的中间神经元中NMDA受体却呈现不同的改变,其水平在0.01mg/kg和0.033mg/kg、0.1mg/kg MK-801处理组显著降低（p＜0.05）,但是NR2C在0.01 mg/kg MK-801处理组呈非显著性降低（p=0.327）,0.1mg/kg MK-801处理并没有显著改变NR1亚单位的水平（p=0.909）,与前额叶皮层组织相似的是,所有NMDA受体亚单位在0.33mg/kg MK-801组没有显著改变而在1.0 mg/kg MK-801组显著降低,所有结果表明PV阳性的中间神经元呈现与前额叶不同的对NMDA受体阻断剂的反应。免疫荧光染色研究选取了两个产生最显著作用的剂量（0.033mg/kg和1.0mg/kg）,从蛋白质水平上证实以上结论。另外,我们发现0.033mg/kg和1.0mg/kg均显著降低了NR2B磷酸化水平。结论:不同剂量的MK-801处理得到的浓度相关性曲线提示,PV阳性的中间神经元中的NMDA受体呈现出双相性的变化,不同于前额叶皮层组织的倒置“U”形曲线,提示该类神经元对MK-801高度敏感,在精神分裂症疾病中作为NMDA受体的功能感受器进而调节前额叶的功能。而且不同剂量MK-801引起前额叶NMDA受体的不同变化也提示精神分裂症复杂的病理机制,并能够解释为什么直接针对于NMDA受体的药物并没有得到理想的治疗效果。第三部分:Ⅱ型代谢型谷氨酸受体激动剂（LY379268）改善MK-801诱导的前额叶NMDA受体功能紊乱及其逆转机制目的:当前临床应用广泛的精神分裂症治疗药物,比如多巴胺受体2拮抗剂clozapine以及五羟色胺受体拮抗剂olanzapine,可以显著改善疾病的阳性症状,但是被发现或者具有较强的副作用,或者一定程度不能消除阴性症状和认知功能的不足。NMDA受体功能低下假说提示谷氨酸神经递质系统可以作为将来治疗药物的靶点,D-serine、glycine和D-alanine的临床应用即是以此为基础,功能集中在对中枢神经系统NMDA受体的激活,增强受体的功能,但是并没有收到显著效果。促代谢型受体（mGluR）的发现改变了关于谷氨酸受体的传统观点,因为虽然谷氨酸是一种兴奋性神经递质,但是这类受体被激活后却发挥抑制性的作用,也可以间接调节NMDA受体的功能,而且与其他G蛋白藕连的受体明显不同,N末端连着非常特殊的大约有550氨基酸组成的细胞外区域。这类受体包括8种不同的亚型,根据序列不同、信号转导通路和对受体激动剂的敏感性,可以分为三类:Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ。不同种类的mGluR分布于不同的大脑区域,而且或分布于神经元,或分布于非神经元,或分布于突触前,或分布于突触后。这种特异分布使靶点位于某mGluR亚型的药物,不直接作用于NMDA受体,而能够选择性调节特定大脑皮层或者特定细胞种属的谷氨酸递质系统,进而达到治疗疾病的目的。最新动物行为研究提示单次注射mGluRⅡ的激动剂可以消除某些动物模型的精神分裂症症状,临床前期研究也表明这类药物具有与多巴胺受体2拮抗剂类似的效果,但是其分子作用机制尚不清楚,而且mGluRⅡ激动剂如何影响NMDA受体的功能以及是否可以逆转受体拮抗剂导致的功能紊乱也未可知。所以我们检测了mGluRⅡ的激动剂对于NMDA受体表达的影响以及长期应用是否可以逆转MK-801引起的NMDA受体表达及磷酸化水平的改变。方法:1.精神分裂症动物模型的制作及治疗2.Western blotting蛋白质定量技术3.逆转录PCR结果:Ⅱ型mGluR激动剂显著改善了前额叶皮层NMDA受体的功能紊乱。一次性单独应用LY379268在0.3mg/kg和3.0mg/kg均显著提高NR2B的表达及磷酸化水平（p＜0.05）。相应剂量的LY379268在注射MK-801 50分钟之后的亚慢性处理（5天）,比如0.3 mg/kg LY379268对应0.033 mg/kg的MK-801和3.0mg/kg的LY379268对应1.0mg/kg的MK-801,逆转了两种剂量的MK-801引起的NR2B的磷酸化水平的降低（pNREB Tyr1472,pNR2Bser1303）（p＜0.05）,至正常水平（p＞0.05对比于对照组）。0.3 mg/kg的LY379268逆转了0.033 mg/kg MK-801引起的NMDA受体表达水平的升高（p＜0.05）,至正常水平（p＞0.05对比于对照组）,3.0 mg/kg的LY379268显著改善1.0 mg/kg MK-801引起的NMDA受体水平的降低（p＜0.05）,但是仍显著低于正常水平（p＜0.05）.结论:传统观点认为mGluRⅡ激动剂可以调节突触前谷氨酸释放,从而降低谷氨酸的兴奋性毒性作用,但是这种主张并不能解释谷氨酸释放抑制剂可以产生与多巴胺受体2拮抗剂类似的抗精神病效果。本实验着眼于mGluRⅡ激动剂引起的突触后改变,第一次揭示这类药物可以选择性调节NMDA受体的功能,并且在不同程度上逆转了MK-801引起的NMDA受体功能紊乱及磷酸化水平的降低。

论文目录

• 引言
• 论文正文
• 第一部分:NMDA受体在大脑前额叶皮层中间神经元的表达
• 中文摘要
• 英文摘要
• 符号说明
• 前言
• 材料与方法
• 1.材料
• 2.方法
• 结果
• 1.NMDA受体基因引物的设计
• 2.NovaRed染色联合激光显微切割技术提取前额叶中小白蛋白阳性的中间神经元
• 3.RNA的完整性检测及aRNA扩增在测定NMDA受体在中间神经元表达过程中的必要性
• 4.NMDA受体在前额叶中的mRNA及蛋白水平的表达
• 5.NMDA受体在前额叶小白蛋白（parvalbumin）阳性的中间神经元的mRNA及蛋白水平表达
• 6.NMDA受体不同亚单位在中间神经元和前额叶表达的对比
• 讨论
• 结论
• 第二部分:MK-801对NMDA受体在前额叶中间神经元表达的不同影响
• 中文摘要
• 英文摘要
• 符号说明
• 前言
• 材料与方法
• 1.材料
• 2.方法
• 结果
• 1.不同剂量MK-801对NMDA受体在前额叶的mRNA及蛋白表达水平的影响
• 2.不同剂量MK-801对NMDA受体在前额叶中间神经元的mRNA及蛋白表达的影响
• 3.MK-801对于NMDA受体在中间神经元和前额叶的表达的不同作用的对比
• 4.NR2A亚单位在MK-801对于前额叶NMDA受体表达的作用过程中起着主导作用
• 5.不同剂量MK-801对前额叶中NMDA受体磷酸化功能的影响
• 6.不同剂量MK-801对前额叶中AKT/GSK-3和MAPK/ERK通路及其磷酸化功能的影响
• 讨论
• 结论
• 第三部分:Ⅱ型mGluR激动剂（LY379268）改善MK-801引起的前额叶NMDA受体功能紊乱及其逆转机制
• 中文摘要
• 英文摘要
• 符号说明
• 前言
• 材料和方法
• 1.材料
• 2.方法
• 结果
• 1.LY379268最佳药物治疗浓度的筛选
• 2.LY379268、氟哌啶醇（haloperidol）和氯氮平（clozapine）对前额叶NMDA受体表达及其磷酸化功能的作用
• 3.LY379268、氟哌啶醇（haloperidol）和氯氮平（clozapine）对前额叶AKT/GSK-3和MAPK/ERK通路及其磷酸化功能的作用
• 4.LY379268改善MK-801引起的前额叶NMDA受体mRNA和蛋白水平的变化
• 5.LY379268通过直接影响NMDA受体的磷酸化功能发挥其治疗作用
• 6.LY279268通过间接调节AKT/GSK-3通路发挥其治疗作用
• 讨论
• 结论
• 论文结论
• 附图表
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文目录
• 附件
• 学位论文评阅及答辩情况表