论文题目: 高血浆皮质酮下调大鼠海马BDNF基因表达的机制研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 生理学
作者: 冯昊
导师: 姚泰,陆利民,朱依纯
关键词: 皮质酮,海马,脑源性神经营养因子,受体,反应蛋白结合元件,应激
文献来源: 复旦大学
发表年度: 2005
论文摘要: 在应激(stress)及衰老等情况下，大鼠血浆皮质酮水平显著升高，升高的皮质酮一方面对机体有保护作用，但同时也带来了对机体的损伤。高浓度的皮质酮可引起脑的海马神经元的特征性形态学损伤：CA3区锥体神经元顶树突的萎缩；还可引起海马神经元长时程增强(long-term potentiation，LTP)的抑制，并引起与海马有关的学习记忆功能损害等。脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)是神经生长因子(neure growth factor，NGF)家族的一员，于1982年首先从猪脑中提取出来(Barde，1982)。BDNF作为一种重要的神经营养因子，具有神经保护功能，并在突触的形成、神经突起形态的维持等方面起着重要的作用。在中枢神经系统中，BDNF的表达在海马中最高。研究表明，BDNF在海马LTP的维持中起关键作用，可影响人和动物的学习与记忆功能。皮质酮可引起海马内BDNF表达的下降。BDNF的减少可能是皮质酮导致海马损伤的一个重要环节。但BDNF的减少究竟是由于转录水平的改变，还是翻译及翻译后加工的变化，尚不完全清楚。目前对于皮质酮下调海马BDNF基因表达的信号转导的机制也不完全了解。因此，我们提出研究课题，对皮质酮下调海马BDNF表达的机制进行研究。我们的实验主要分以下三部分：第一部分：观察不同剂量与时间点单次皮下注射皮质酮对海马BDNF基因表达的影响。这一部分实验主要应用半定量RT-PCR、western blot等实验方法观察皮下注射不同剂量皮质酮及不同时间点后海马BDNF mRNA、各外显子mRNA及BDNF蛋白的变化。动物模型为皮下注射皮质酮聚乙二醇溶液的雄性Sprague Dawley大鼠，设立5个实验组进行观察：第一组是只注射聚乙二醇的对照组，第二、三、四、五组为皮下注射皮质酮组，其中第二组为注射1mg/kg后3小时进行观察，第三组为注射1mg/kg后6小时进行观察，第四组为注射2mg/kg后3小时进行观察，第五组为注射2mg/kg后6小时进行观察。实验结果显示：在给予皮质酮1mg/kg后3小时与6小时及2mg/kg后3小时与6小时，用半定量RT-PCR的方法观察到海马的BDNF mRNA含量与对照组相比显著降低(P＜0.01)，1mg/kg 3小时组海马BDNF mRNA水平低于1mg/kg 6小时组(P＜0.05)，2mg/kg 3小时组海马BDNF mRNA水平低于2mg/kg 6小时组(P＜0.05)；给予皮质酮1mg/kg后3小时与6小时，BDNF exon1 mRNA水平与对照组相比显著降低(P＜0.05)，给予皮质酮2mg/kg后3小时与6小时，BDNF exon1 mRNA水平与对照组相比亦显著降低(P＜0.01)；给予皮质酮1mg/kg后3小时与6小时及给予皮质酮2mg/kg后3小时与6小时，海马的BDNF exon3mRNA含量与对照组相比显著降低(P＜0.01)，exon2 mRNA及exon4 mRNA与对照组相比均无显著性差异。进一步用Western blot的方法观察到，给予皮质酮1mg/kg后3小时海马的BDNF蛋白含量与对照组相比显著降低(P＜0.05)；给予皮质酮1mg/kg后6小时及皮质酮2mg/kg后3小时与6小时后，海马的BDNF蛋白含量与对照组相比都显著降低(P＜0.01)。给予皮质酮1mg/kg后6小时组的海马BDNF蛋白水平明显低于给予皮质酮1mg/kg后3小时组(P＜0.05)；给予皮质酮2mg/kg后3小时组的海马BDNF蛋白水平也明显低于给予皮质酮1mg/kg后3小时组(P＜0.01)。归纳起来，这一部分的实验提示：一次性皮下注射皮质酮可引起海马BDNF mRNA及蛋白水平的下调，且存在剂量与时间依赖关系，BDNF mRNA在用药后3小时降低，6小时已开始升高；BDNF蛋白在6小时低于3小时水平，与BDNF mRNA相比存在滞后现象；同时，BDNF exon1及exon3 mRNA水平的变化与BDNF mRNA的变化一致，提示BDNF mRNA的变化可能主要是由exon1及exon3的变化引起的。第二部分：观察NMDA受体阻滞剂MK801在皮质酮抑制海马BDNF基因表达中的作用。本实验将动物分为4组：第一组为注射PEG的对照组；第二组为皮下注射皮质酮2mg/kg；第三组为腹腔注射ME801 0.2mg/kg；第四组为先腹腔注射MK801 0.2mg/kg，30分钟后再皮下注射皮质酮2mg/kg。注射皮质酮后3小时(在MK801组即注射MK801后3小时30分钟)，将动物快速断头处死。用RT-PCR方法测海马BDNF mKNA的水平，用western blot方法测海马内BDNF蛋白及cAMP反应元件结合蛋白(cAMP response element-binding protein，CREB)、pCREB的水平。实验结果显示：单纯给予皮质酮后，动物海马内的BDNF mRNA、proBDNF、成熟BDNF及CREB的磷酸化水平均比对照组低；单纯给予MK801后，上述各个指标与对照组相比并无显著差别；在给予MK801后再注射皮质酮的动物，海马组织内proBDNF、成熟BDNF及pCREB比单纯给予皮质酮动物都显著性降低，BDNF mRNA比单纯给予皮质酮动物也降低，但尚未有统计学显著意义。这些结果表明：在皮质酮引起海马BDNF基因表达下调的过程中，转录因子CREB是一个重要的中间环节，CREB的磷酸化的抑制可能是引起BDNF转录下调的主要原因，而NRMDA受体的激动可能是维持BDNF表达的一个因素，成为一种保护性因素。当用MK801阻断NMDA受体后，BDNF的转录水平的降低就更加明显。第三部分：观察冠状动脉左前降支结扎大鼠及束缚性应激大鼠血浆皮质酮水平的变化情况，同时观察束缚性应激大鼠海马内谷氨酸水平的变化。将实验动物分成3天、1周、3周三个时间点。结果显示冠状动脉结扎组动物及束缚性应激动物各个时间点的血浆皮质酮均明显上升。但冠状动脉结扎的假手术组血浆皮质酮也明显升高，因此不能得出单纯心肌梗塞可使大鼠血浆皮质酮水平升高的结论。用高效液相色谱荧光检测法检测束缚性应激大鼠海马组织的谷氨酸水平，未发现有显著性的改变。综上所述，我们的实验提示：血浆皮质酮升高可下调海马BDNF基因的表达，这种下调有时间与剂量依赖关系，其机制可能是抑制了L型电压依赖性钙通道，使转录因子CREB磷酸化水平降低，从而减少了BDNF exon1与exon3的转录水平，最终使BDNF的mRNA及蛋白水平下降。NMDA受体的激动可增强BDNF的表达，因此当NMDA受体被MK801阻断后，皮质酮下调BDNF基因表达的效应明显增强。
论文目录:
中文摘要
英文摘要
前言
第一部分 皮质酮引起海马BDNF mRNA与蛋白及BDNF各外显子mRNA改变的时间剂量效应
材料与方法
实验结果
讨论
小结
第二部分 MK801增强皮质酮对海马BDNF表达的抑制效应
材料与方法
实验结果
讨论
小结
第三部分 心肌梗塞动物血浆皮质酮水平的变化及束缚性应激动物海马组织中谷氨酸水平的改变
材料与方法
实验结果
讨论
小结
参考文献
致谢
附录1 研究生期间发表和待发表的文章
附录2 综述:大鼠BDNF基因转录调控的分子机制
参考文献
发布时间: 2007-06-28
参考文献
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