大肠癌发生与肝转移蛋白质组表达差异及其意义的研究

论文摘要

肝脏是结直肠癌转移最常见的器官，临床上结直肠癌患者根治性手术切除后发生肝转移是影响患者预后的主要原因。为了深入研究大肠癌发生、发展及肝转移的分子机理，以提高对大肠癌肝转移的防治效果，我们采用蛋白质组学研究方法，对比分析正常结直肠粘膜、癌原发灶、肝转移灶组织中蛋白组表达差异，分离、鉴定结直肠癌发生和肝转移的相关蛋白，并研究其对结直肠癌细胞生物学行为的影响，从而为筛选临床肿瘤标志物和治疗靶标提供依据。 【材料和方法】一、标本采集：我院结直肠癌伴肝转移患者20例，男女各10例。年龄36-67岁。均行手术治疗，经病理组织学证实，Duke’s分期为D期。手术中取手术切除新鲜标本，大肠癌原发灶、正常肠粘膜、肝转移灶组织，贮于液氮中冻存备用。二、蛋白质样品制备及双向凝胶电泳：等电聚焦按照Ampharmacia操作方法进行，组织蛋白提取物经Bradford法定量后取500μg与水化溶液（7M尿素、2M硫脲、2％CHAPS、15mmol／L DTT、0 5％IPG缓冲液pH 3—10、痕量溴酚蓝）混合，总体积200μl，与IPG胶条共同泡胀，总电压伏小时达到40kVh，最大电压至8000V。等电聚焦结束后，用一步平衡法平衡15分钟，平衡液成分为50mmol／L Tris缓冲液（pH8.8），含2％W／V SDS，5mmol／L TBP，6mol几尿素和30％甘油。然后用12.5％凝胶做第2向SDS-PAGE胶恒流电泳，7h。电泳温度15℃。电泳后考马斯亮兰染色及脱色。三、图象采集与分析：用Micotech K8扫描仪，600dpi分辨率扫描染色凝胶。图象以Melanie 3.0软件（GeneBio，Geneva）分析。每种组织三次电泳凝胶图象经背景消减、斑点检测与配比，得到标准胶，再经配比产生差异表达蛋白点数据信息。四、质谱分析及质谱数据库搜寻：用LCQ DECA XPplus质谱仪（ThermoFinnigan，USA）对胶上消化后的差异蛋白点进行质谱分析。获得的肽序列数据用Mascot软件在NCBI的nr数据库中搜寻。五、用常规RT-PCR方法克隆差异表达蛋白基因全长cDNA。构建真核表达载体pcDNA3.1-CA。采用脂质体转染法将pcDNA3.1-CA转染人直肠腺癌HR-8348及结肠腺癌lovo细胞。六、结直肠癌细胞生物学行为改变得观察：四唑盐（MTT）比色试验：以转染pcDNA3.-CA的细胞为实验组；以未转染pcDNA3.1-CA的细胞为对照组。分别观察其对5-Fu及奥沙利铂药物的抑制率。抑制率=[1-（实验组吸光度值／空白对照组吸光度值）]×100％。七、统计学处理：应用SPSSl 2.0统计软件

论文目录

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• 前言
• 材料与方法
• 主要试剂和材料
• 实验方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 结论
• 致谢
• 综述
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