论文摘要
质粒DNA作为生物药剂（尤其作为基因治疗和基因疫苗的载体）的意义和需求越来越大。质粒DNA作为一种新的非病毒转基因载体,优点是安全可靠、稳定、对外源基因的容纳量大、不会引起免疫系统反应及易于生产等。随着基因治疗和DNA疫苗从实验室进入临床研究和批准上市,必须开发出一个重复性高、易于放大的质粒生产工艺,从而大量生产可作为生物药剂的质粒DNA。本文对利用重组大肠杆菌（E.coli DH5α/）发酵生产质粒pUK21CMVβ1.2的培养基及发酵工艺进行系统的研究。首先考察培养时间、转接次数和选择压力对质粒稳定性及产量的影响,结果表明重组菌在LB培养基中的最佳质粒收获时间为13h,选择性压力对质粒稳定性及产量影响较小,质粒具有较好的结构稳定性和分离稳定性。对重组大肠杆菌培养基中碳、氮源和碳氮比等因素进行优化,结果表明蔗糖、酪蛋白胨分别为最佳碳源、氮源,最佳碳氮比为3.82:1。在单因素优化基础上采用Box-Behnken设计法和RSM响应面分析法确定出质粒生产的最佳培养基组成为:酪蛋白胨(10.42 g L-1),蔗糖(9.96 g L-1),氯化钠(10 g L-1),酵母粉(5 g L-1),硫酸铵(6.4 g-1),甘油(9.80 g L-1)。采用优化后的培养基摇瓶培养24 h,质粒的产量和生物量分别达到51.80 mg L-1和2.57 g L-1,分别是初始LB培养基的3.54倍和2.5倍。采用2 L Braun发酵罐,首先对流加时期和流加物质进行考察,结果表明对数期流加葡萄糖和优化培养基均对菌体生长产生抑制,对质粒产量没有明显的促进作用。稳定期流加葡萄糖对菌体生长无促进作用,对质粒产量有一定促进作用;而稳定期流加优化培养基对菌体生长和质粒生产没有明显的促进作用。pH-stat流加方式可大大提高菌体的比生长速率和质粒的产量,当采用2×优化培养基恒pH值发酵时,最大质粒产量和生物量分别达到601.9 mg L-1和16.78 g L-1,分别是间歇培养的6.63倍和2.53倍。
论文目录
摘要ABSTRACT第一章 文献综述1.1 基因治疗和基因载体1.1.1 人类基因组计划（Human Genome Project, HGP）1.1.2 基因治疗（gene therapy）1.1.3 基因载体1.2 非病毒转基因载体─质粒DNA1.2.1 质粒DNA概述1.2.2 质粒载体1.2.3 质粒载体的质量标准1.3 质粒DNA的稳定性1.3.1 质粒DNA的稳定性类型1.3.2 质粒DNA稳定性的影响因素1.3.3 提高质粒DNA稳定性的方法1.4 大肠杆菌高密度发酵生产质粒DNA1.4.1 影响高密度发酵的表观因素1.4.2 高密度发酵生产质粒DNA的途径1.5 课题提出的依据及研究目的1.5.1 依据1.5.2 研究目的第二章 材料与方法2.1 实验材料2.1.1 菌种和质粒2.1.2 主要原料及试剂2.1.3 培养基2.2 主要实验仪器2.3 培养条件2.3.1 种子培养条件2.3.2 摇瓶发酵条件2.3.3 发酵罐初始培养条件2.4 实验方法2.4.1 菌体生长量测定2.4.2 溶液及分析试剂的配制2.4.3 质粒DNA的提取2.4.4 核酸测定2.4.5 凝胶电泳2.4.6 质粒分离稳定性的测定2.4.7 葡萄糖浓度的测定2.4.8 蔗糖浓度的测定2.4.9 氨浓度的测定第三章 质粒DNA的稳定性性质分析3.1 培养时间对质粒产量及稳定性的影响3.2 转接次数对质粒产量及稳定性的影响3.3 选择性压力对质粒产量及稳定性的影响3.4 本章小结第四章 重组菌摇瓶培养条件的优化4.1 培养基种类优化4.2 碳源优化4.2.1 碳源种类对菌体生长和质粒产量的影响4.2.2 初始碳源浓度对菌体生长和质粒产量的影响4.3 氮源优化4.3.1 氮源种类对菌体生长和质粒产量的影响4.3.2 初始氮源浓度对菌体生长和质粒产量的影响4.4 碳氮比对菌体生长和质粒产量的影响4.5 氨基酸对菌体生长和质粒产量的影响4.6 培养基配方的优化4.7 培养基优化前后菌体生长和质粒DNA产量的比较4.8 本章小结第五章 发酵罐培养工艺的优化5.1 间歇发酵5.2 流加发酵5.2.1 对数期流加5.2.2 稳定期流加5.2.3 pH-stat流加5.3 本章小结第六章 结论与展望6.1 结论6.2 存在问题及展望参考文献附录在读期间发表论文致谢
相关论文文献
标签：质粒论文; 重组大肠杆菌论文; 培养基论文; 发酵论文; 流加论文;
