耐受有机溶剂的脂肪酶产生菌的筛选及其酶的分离纯化的研究

论文摘要

脂肪酶（Lipase,EC3.1.1.3）是分解三脂酰甘油的水解酶类,它不仅能将底物三脂酰甘油水解为丙三醇和脂肪酸,还能催化水解反应的逆反应,其催化作用具有精确的区域选择性和立体选择性。它不仅在异相系统（油-水界面）中发生作用,而且有些脂肪酶在有机相中也能起催化作用。近年来,随着非水相酶学的不断深入,脂肪酶的应用已超出了油-水界面上进行水解反应的范围,被广泛应用于酯合成、手性化合物的拆分、化工合成中间体的选择性保护、高聚物的合成、肽合成等方面,具有广阔的应用前景。近年来对酶在有机介质中催化作用的研究已有大量报道,而采用完整微生物细胞在有机介质中作为生物催化剂的研究却不多见。由于不同菌种来源的脂肪酶的酶学性质和作用机理不同,同时不同菌种所需的营养与培养条件也不同,探讨菌种对不同溶剂的敏感性可为研究在有机溶剂中的催化反应奠定基础。而对酶的各方面的研究要求必须对酶进行纯化。本论文对耐受有机溶剂的产脂肪酶菌种进行了筛选及鉴定,优化了产酶条件,并对产生的脂肪酶进行了分离纯化和酶学特性的研究。包括以下研究内容:1.从成都及周边地区的油脂厂、乳品厂、食堂、果园采集土样35份,筛选得到一株耐受有机溶剂的脂肪酶产生菌,命名为L-42,该菌可以在10%的丙酮、石油醚、环己烷、丙三醇中生长良好。根据菌体形态观察、生理生化鉴定和16S rDNA序列分析,该菌株被鉴定为粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）。L-42所产脂肪酶经酯酶同工酶活性染色鉴定有三个同工酶。2.对筛选得到的L-42菌株产酶发酵条件进行了优化,确定最佳培养基组成成分为:酵母粉1.0%,可溶性淀粉1.0%,橄榄油1.0%,K2HPO40.2%,KH2PO40.1%,MgSO4·7H2O 0.1%,Tween 80 0.1%,pH7.0。最佳摇瓶培养条件为:温度30℃,转速200r/min。优化条件后所产酶活力可达到优化前的2倍。3.对L-42菌株所产脂肪酶进行了分离纯化研究。菌体发酵液经过丙酮沉淀、DEAE-Sepharose离子交换和Sephadex G-100凝胶过滤等步骤处理,最终将酶纯化了45.57倍,比活为1166.61 U/mg,回收率为20%。纯化的酶经SDS-PAGE分析为单一蛋白染色带。4.对酶的部分酶学性质的研究,发现其酶活最适pH为9.0,最适温度为35℃,分子量约为50kDa。测试了K+、Ca2+、Co2+、Fe2+、Cu2+、Mn2+、Mg2+、Ni+等九种金属离子对酶活的影响,发现该酶对金属离子均很敏感,Ca2+、Mg2+、K+、Mn2+、Ni+对酶有激活作用,而Sn2+、Fe2+、Zn2+、Co2+对酶活有抑制作用。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1 脂肪酶的研究概况
• 1.1 微生物脂肪酶的来源
• 1.2 脂肪酶产生菌的筛选方法
• 1.3 脂肪酶活力测定
• 1.4 脂肪酶的发酵生产
• 1.5 脂肪酶理化特性
• 1.6 脂肪酶的分子结构和催化机制
• 2 脂肪酶的纯化技术
• 2.1 有机溶剂沉淀
• 2.2 硫酸铵盐析
• 2.3 离子交换层析
• 2.4 凝胶过滤层析
• 2.5 疏水层析
• 2.6 亲和层析
• 2.7 双水相萃取技术
• 2.8 嗜硫色谱法
• 2.9 反胶团系统法
• 3 脂肪酶的应用
• 3.1 脂肪酶在食品工业和香料制造中的应用
• 3.2 脂肪酶在洗涤剂行业中的应用
• 3.3 脂肪酶在手性化合物合成与拆分中的应用
• 3.4 脂肪酶在医药和化妆品中的应用
• 3.5 脂肪酶在合成生物柴油中的应用
• 3.6 脂肪酶在其他工业中的应用
• 4 微生物脂肪酶的研究展望
• 第二章 脂肪酶产生菌的筛选、鉴定及产酶条件的优化
• 1 材料与试剂
• 1.1 土样来源
• 1.2 试剂与设备
• 1.3 主要试剂的配制
• 1.4 培养基
• 2 方法
• 2.1 脂肪酶产生菌的筛选
• 2.2 菌株有机溶剂耐受性检测
• 2.3 脂肪酶活性测定
• 2.4 菌种的鉴定
• 2.5 酯酶同工酶活性染色法
• 3 结果与分析
• 3.1 产脂肪酶细菌菌株的分离
• 3.2 菌株 L-42 的鉴定
• 3.3 酯酶活性染色
• 3.4 菌株发酵产酶条件优化
• 4 结论
• 第三章 碱性脂肪酶的分离纯化及其性质研究
• 1 材料与试剂
• 1.1 实验材料
• 1.2 主要仪器及试剂
• 2 实验方法
• 2.1 蛋白质浓度的测定方法
• 2.2 脂肪酶活性平板检测
• 2.2 粗酶液的制备
• 2.3 脂肪酶的分离纯化
• 2.4 纯度和相对分子质量的鉴定
• 2.5 脂肪酶的部分酶学特性
• 3 结果与分析
• 3.1 脂肪酶的分离纯化结果
• 3.2 脂肪酶纯度的测定和相对分子质量的测定
• 3.3 脂肪酶的部分酶学特性
• 4 小结
• 第四章 全文小结
• 参考文献
• 致谢
• 附录
• 附录一:L-4216S rDNA 全序列测定
• 附录二:在读期间发表论文情况