S型氯代甘油醇抗雄性大鼠生育作用研究

论文摘要

氯代甘油醇,（α-chlorohydrin,ACH）,化学名3-氯-1,2-丙二醇（3-mono-chloro-propane-1,2-diol,3-MCPD）,ACH是一种重要化工原料,普通人群可通过食用受污染的食物或以树脂生产的饮水暴露ACH。ACH被认为是经典的睾丸后毒物,短期低剂量经口染毒ACH可致多种雄性动物可逆性的不育。由于ACH抗雄性生育力作用环节及机制尚未阐明,故本研究以探察S-ACH抗雄性大鼠生育作用特点为切入点,探讨S-ACH的抗生育作用环节及可能的相关机制。第一部分S型氯代甘油醇对雄性SD大鼠生殖能力的影响成年雄性SD大鼠40只,随机分为4组,每组10只,对照组施以等体积双蒸水,实验组分别经口施予2.5,5.0,10.0mg/（kg·bw）S-ACH。持续52天染毒,染毒第10天起按雄:雌1:1合笼,连续合笼1周未发现交配则增添一只雌鼠合笼。交配成功后雌、雄鼠分开饲养,于交配后12-15天开腹检查雌鼠受孕状况。停止染毒14天后每组取5只雄鼠,按上述方法进行交配试验2周。分别计算雄鼠交配指数和生育力指数。染毒52天后检查睾丸生精能力和肝、肾、睾丸及附睾组织病理学变化,并观察停止染毒4周后各项受损指标的恢复情况。结果显示,染毒10天后各剂量组雄鼠生育力指数均为0,交配指数与对照组相比无显著差异（P＞0.05）。停止染毒14天后,2.5mg/kg剂量组雄鼠生育力指数明显恢复,在5mg/kg和10mg/kg剂量组则部分恢复,交配指数仍未受影响。各染毒剂量组的睾丸生精能力与对照无显著差异,肝、肾、睾丸组织病理学检查均未见异常。在10mg/kg剂量组大鼠附睾发现轻度的间质炎症反应。在5mg/kg和10mg/kg剂量组发现3例附睾精液囊肿。研究结果提示,S-ACH的作用靶点可能是发生后期的精细胞或处于成熟阶段的附睾内精子,附睾可能是S-ACH产生毒效应的靶器官。第二部分S-型氯代甘油醇抗雄性大鼠生育的作用环节研究为探讨S-型氯代甘油醇抗雄性大鼠生育的作用环节,本研究检测S-ACH染毒对精子运动和超活化运动的影响。1.S-ACH对大鼠精子运动的影响。雄性SD大鼠40只,随机分为4组,每组10只,采用灌胃染毒,对照组施以等体积双蒸水,实验组分别施予2.5,5.0,10.0mg/（kg·bw）S-ACH,染毒持续52天。染毒期满后每组留5只停止染毒,常规饲养4周。分别在染毒期满后及停止染毒4周后每剂量组取3只雄鼠检测精子运动。游出法收集大鼠附睾尾精子,移至支持大鼠精子获能的IVF培养液中,调整精子浓度为2×106个/ml,37℃,5%CO2孵育。采用计算机辅助精子分析法（CASA）分别于孵育后的0,2,4,5h检测精子运动和4h时精子超活化状态。2.研究体外S-ACH染毒对精子受精的影响。用超排卵方法收集大鼠卵子,游出法收集雄鼠精子到IVF培养液,调整浓度为2×106精子/ml,平均分为4份,加入S-ACH,终浓度分别为0,0.1,1.0,10 mM。分别取含各浓度ACH的精子悬液50μl到35mm玻璃培养皿,矿物油封盖,将卵子平均分配到4份染毒精子悬液中,37℃,5%CO2培养36h,镜下观察卵裂数,计算受精率。结果显示,S-ACH对精子运动影响与染毒剂量和孵育时间有关,S-ACH可显著抑制大鼠精子运动能力,其中VCL、VAP、VSL、ALH最为敏感,随着染毒剂量增加,运动速率下降和运动方式均发生改变。在10.0mg/（kg·bw）S-ACH精子,随着孵育时间延长精子运动显著下降。S-ACH可显著降低大鼠精子体外获能条件下超活化运动比例,其影响程度超过精子一般运动能力改变。停止染毒后运动和超活化运动均可恢复。S-ACH体外染毒后,体外受精率随剂量增大呈下降趋势。第三部分S-型氯代甘油醇抗雄性SD大鼠生育的基础研究为研究S-ACH抗雄性SD大鼠生育的基础,本研究检测S-ACH染毒对大鼠精子GAPDS活性、ATP和S-ACH对蛋白酪氨酸磷酸化信号转导通路的影响。雄性SD大鼠40只,灌胃染毒0,2.5,5.0,10.0mg/（kg·bw）S-ACH 52天,取5只停止染毒,常规饲养4周。分别检测染毒52天和停止染毒4周后大鼠附睾精子GAPDS活性和ATP水平。精子GAPDS活性通过检测该酶催化产物的340nm吸光度变化率计算,化学发光法进行测定ATP含量。检测获能条件下体外染毒0,0.1,1.0,10 mM S-ACH后精子酪氨酸磷酸化水平。结果显示,S-ACH可显著抑制大鼠精子GAPDS活性,GAPDS活性抑制和染毒剂量存在明显的剂量-效应关系。停止染毒后酶活性可恢复。染毒后ATP水平无显著改变。染毒期和恢复期的附睾精子cAMP水平随S-ACH染毒剂量增高附睾精子cAMP水平呈下降趋势,Pentoxifylline可增加精子cAMP水平。S-ACH体外染毒对获能条件下精子蛋白酪氨酸磷酸化无明显改变。

论文目录

• 缩略语表
• 中文摘要
• Abstract
• 前言
• 技术路线
• 第一部分 S型氯代甘油醇对雄性大鼠生殖能力的影响
• 第一节 S型氯代甘油醇对雄性大鼠交配能力、生育力及肝肾病理的影响
• 第二节 S型氯代甘油醇对大鼠睾丸、附睾组织病理学的影响
• 第一部分小结
• 第二部分 S-型氯代甘油醇抗雄性大鼠生育的作用环节研究
• 第一节 S型氯代甘油醇对大鼠精子运动能力的影响
• 第二节 S型氯代甘油醇对大鼠精子的超活化运动的影响
• 第二部分小结
• 第三部分 S-型氯代甘油醇抗雄性大鼠生育的基础研究
• 第一节 S型氯代甘油醇对大鼠精子GAPDS活性和ATP含量的影响
• 第二节 S型氯代甘油醇对大鼠精子蛋白酪氨酸磷酸化的影响
• 第三部分小结
• 结论
• 参考文献
• 综述
• 硕士研究生期间发表文章
• 致谢