表达人CD14的U937细胞系的初步构建

论文摘要

研究背景:脓毒症（sepsis）至今仍是造成临床病人发生多器官衰竭（MOF）甚至死亡的重要原因。其主要机制是内毒素或脂多糖（LPS）激活单核—巨噬细胞系统（MPS）释放多种细胞因子,如SCD14,TNF-a,IL-6、10和NO等引起的介质病。内毒素是一种脂多糖成分（LPS）,而单核—巨噬细胞（MO）表面存在一种糖蛋白--CD14,被认为是介导内毒素信号转导,激活单核巨噬细胞的重要受体,在LPS的信息传递中起启动作用。故CD14与细胞释放炎症介质有关,CD14表达变化是机体对内毒素反应敏感性的基础。单核细胞来源的细胞株U937是研究离体MO的重要的细胞株,大多数研究室通过VitD3诱导U937来获得CD14阳性表达的细胞系,但不能保证CD14表达的均一性和膜稳定性,不利于CD14介导内毒素信号转导与细胞释放炎症介质的重要机制研究,因此我们进行了本课题研究。研究目的:构建稳定表达人CD14蛋白的人单核细胞系U937细胞株,为了便于研究关于LPS介导下CD14在单核-巨噬细胞（MO）膜上的表达,以及在U937细胞中CD14mRNA的表达,及其在分泌不同细胞因子中的作用机制。为研究CD14在LPS性炎症反应、内毒素休克提供有利工具。基本研究内容:pDisplay/CD14重组质粒的构建,利用PDGFR的跨膜肽,构建以跨膜蛋白形式稳定表达CD14分子的白血病细胞株U937/mCD14。方法:通过PCR方法将CD14在基因水平上扩增,克隆入pGEM（R）-T Easy载体,然后转化DH5α细菌,酶切鉴定并纯化阳性重组子,测序后进行在线核苷酸序列分析。再将pDisplay载体和PMD18-T/CD14用限制性内切酶BgⅠⅡ同时进行单酶切,纯化回收CD14和pDisplay载体,用T4连接酶进行连接反应。同样转化入DH5α细菌中,酶切鉴定并纯化阳性重组子,测序后进行在线核苷酸序列分析。常规方法复苏、培养U937细胞,收集对数生长期U937细胞,通过G418对U937细胞最小致死量的测定试验,确定G418的筛选浓度,用Superfect transfectionreagent将重组质粒pDisplay/CD14转染到U937细胞,经G418筛选,用流式细胞术检测CD14蛋白的表达情况,初步筛选出CD14阳性的细胞系U937/mCD14。结果:通过PCR扩增了CD14基因后,成功构建了PMD18-T/CD14质粒,以及pDisplay/CD14重组质粒。经不同浓度梯度G418的培养基进行细胞培养,确定U937细胞的G418筛选浓度为500 ug/ml。利用pDisplay载体的G418抗性,初步培养出已转染了pDisplay/CD14的U937细胞株,流式细胞术筛选到2个CD14阳性表达的细胞系U937/mCD14（G418筛选1个月及三个月组的CD14-PE检测的阳性细胞百分数分别为23.21%和37.01%,2F9-FITC检测结果分别为22.59%和36.79%）,仅部分细胞发现CD14mRNA和蛋白表达,表明细胞系不纯。结论:初步建立了表达人CD14的U937细胞系,为研究CD14在LPS性炎症反应、内毒素休克提供了有利条件。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• Abstract
• 目次
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.2 方法
• 3 结果
• 3.1 CD14 基因的克隆和测序
• 3.2 pDisplay/CD14 重组质粒的构建与序列分析
• 3.3 G418 对 U937 细胞的最小致死浓度
• 3.4 CD14 阳性 U937/mCD14 细胞的鉴定
• 4 讨论
• 5 结论
• 参考文献
• 综述
• 作者简历及在学期间发表的文章