论文摘要
地。此外海洋野生资源已不能满足人类的需求,因此亟需对物种进行人工繁育及养殖。要解决以上问题就必须对物种的遗传背景有较全面的了解。查阅文献发现本研究的6个物种均未受到水产界学者的太多关注,因此本研究首次采用微卫星分子标记技术筛选出旗江珧（Atrina vexillam）、粒花冠小月螺（Lunella coronata granulata）、褐毛鲿（Megalonibea fusca）、细角螺（Hemifusus termatamus）4个物种的微卫星位点以及在前人已开发的基础上继续对褐篮子鱼（Siganus fuscescens）和褐鲳鲉（Sebastiscus marmoratus）进行微卫星标记的筛选,以期为这6个海洋物种提供遗传信息,为其种子资源评估,资源保护及人工育苗等方面提供科学依据。6个物种的微卫星发育及遗传多样性结果如下:1、采用FIASCO法构建旗江珧微卫星文库。随机挑取236个片段大小为500-1000bp的阳性克隆进行测序,结果共获得158条含有微卫星片段的序列。挑取微卫星重复次数为5-30的序列进行引物设计,结果共设计出48对引物,利用海南群体30个个体对其进行多态性筛选和遗传多样性评估,最终获得11对多态性微卫星引物。11个位点的遗传信息评估显示,多态信息含量（PIC）为0.199-0.831,等位基数（Na）为2-8个,观察杂合度和期望杂合度分别为0.1000-0.8667和0.1244-0.8356;11个位点中9个位点符合Hardy-Weinberg平衡（P>0.05）,位点Av3-25和位点Av1-32偏离HWE平衡;多态性分析结果显示,仅有位点Av3-25为低多态位点,其余十个位点均为中度和高度多态位点。2、采用FIASCO法构建粒花冠小月螺微卫星文库。随机挑选310个阳性克隆进行测序,结果同获得148条含有微卫星片段的DNA序列,通过分析序列的核心重复次数和保守片段大小,设计并合成60对引物。利用厦门海域的30个个体对其进行筛选,结果共获得10对显示出个体间多样性引物。进一步的遗传信息评估显示,10个微卫星位点的期望杂合度和观察杂合度分别为0.0667-0.7333和0.0644-0.6628,多态信息含量（PIC）为0.305-0.559,其中位点Lc2-32、Lc4-22和位点Lc4-50为高度多态性,其余位点均为中度多态性。Hardy-Weinberg平衡检测,结果显示位点Lc2-32、Lc4-22严重偏离Hardy-Weinberg平衡,剩余8个位点符合HWE（P>0.05）平衡。3、采用FIASCO法构建细角落微卫星基因组文库。随机选取248个片段大于500bp的阳性克隆进行测序。结果显示,在220个成功测序的阳性克隆中共获得278个微卫星序列,其中完美型171个,占61.5%;非完美型81个,占29.1%;复合型26个,占9.4%。除探针使用的GT和CT的重复序列外,还筛选到三碱基GTT、TGG、GAA、CAA;四碱基TCTA、ACAG、TAGA、GTGA、GTCT、GATA及五碱基TTTTG的重复序列。设计合成58对引物,用30个人工养殖的子一代个体对其进行多态性筛选,结果筛选出9对单态微卫星引物,这一结果表明细角螺子一代个体间的微卫星多态性极不显著。4、采用FIASCO法,构建褐毛鲿微卫星文库。随机挑取片段大小在500-1000bp的242个阳性克隆进行测序,经分析微卫星侧翼序列后,共设计41对扩增引物。将合成的引物对褐毛鲿1个群体的30个个体进行遗传多样性检测,结果共筛选出10个多态性位点,10个位点中包括2个高度多态性位点,6个中度多态性位点和2个低度多态性位点。10对多海洋动物是主要的蛋白提供源,对人类有着重要作用。但目前海洋环境的恶化,导致海洋动物的资源数量和质量都随之受到了严重影响,甚至有些海洋物种处在濒临灭绝的境态引物在30个个体中扩增出的等位基因数为2-5;褐篮子鱼群体的多态信息含量（PIC）、观察杂合度（Ho）、期望杂合度（He）的范围分别为0.000-0.624、0.0667-0.7667、0.0644-0.5828;其中8对符合Hardy-Weinberg平衡（P>0.05）,位点Mf25和Mf30偏离HWE平衡。5、采用FIASCO法,构建褐篮子鱼微卫星文库。测序及侧翼序列分析后,共设计48对引物。用褐篮子鱼1个野生群体的32个个体对其进行多态性检测及遗传多样性评估,结果共筛选出15对多态性微卫星引物,其中包括7个高度多态性位点,6个中度多态性位点和2个低度多态性位点;这些微卫星位点的等位基因数为2-12;其多态信息含量（PIC）、观察杂合度（Ho）、期望杂合度（He）的范围分别为0.210-0.849、0.1429-0.8077、0.2246-0.8533;其中13个位点符合Hardy-Weinberg平衡（P>0.05）,位点Sf1-37-2和位点Sf47严重偏离HWE平衡。6、采用FIASCO法,构建褐鲳鲉微卫星文库。经测序及侧翼序列分析后,共设计46对引物,用厦门采集的32个野生褐鲳鲉个体对其进行多态性检测,结果共筛选出11个多态性微卫星微点。这些位点在32个个体中扩增出的等位基因数为2-8,多态信息含量为0.155-0.752,观察杂合度（Ho）和期望杂合度（He）的范围分别为0.186-0.969和0.0.170-0.782。其中,10个微卫星位点符合Hardy-Weinberg平衡（P>0.05）,1个严重偏离HWE平衡。本研究共对6个海洋动物的微卫星位点进行筛选,结果除细角螺未筛选出微卫星多态位点外,其他5个物种均实现微卫星多态位点的筛选。这一结果表明,物种微卫星分子标记在诸多物种中方可筛选得到,但同时也给予了提醒:用于物种遗传多样性研究的群体应该随机采样,以避免采集到的样品都是来自相同亲本的子一代个体。3种海洋鱼类的遗传评估结果显示,褐毛鲿的遗传多样性和多态信息含量较低均低于褐篮子鱼和褐鲳鲉。这一结果可能与褐毛鲿自然资源分布范围小,种群数量较少有关,也可能与其野生物种数量的减少,养殖规模扩大,致使近交和近交衰退现象出现有关。这一现象提醒我们,应及时采取有效保护措施对该物种进行保护。本研究筛选出的11个旗江珧微卫星位点、10个粒花冠小月螺微卫星位点、10个褐毛鲿微卫星位点、15个褐篮子鱼微卫星位点及11个褐鲳鲉微卫星位点可用于物种群体遗传学、进化遗传、性状相关的QTL定位分析、种质鉴定、遗传连锁图谱制备以及遗传育种等领域的研究,最终实现对物种的合理开发和保护。最后,从6个物种微卫星位点的筛选中总结出了涉及微卫星标记技术路线的主要4个方面:一是微卫星位点的开发,二是设计合成高质量的引物,三是PCR扩增与结果检测,四是数据分析。
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