肺癌脑转移相关分子及其作用机制的研究

论文摘要

研究背景肺癌脑转移是肺癌患者的重要致死原因之一,新诊断的非小细胞肺癌患者中就有310%存在脑转移,小细胞肺癌患者中可达到15%。未经治疗的脑转移癌患者中位生存时间仅有3个月左右。在脑转移癌患者中肺癌又是最常见的原发肿瘤,研究表明,就诊的患者中以肺癌为原发肿瘤的患者高达39%。目前认为脑转移的形成是循环中的肿瘤细胞及瘤栓血源性播散的结果,对转移过程中的各个环节及有关分子的具体作用机制等方面也有了一定的研究,但仍有待进一步确认和研究。如EGFR野生型及突变型与恶性肿瘤脑转移的关系仍有待确证。目前已经明确S100B是恶性黑色素瘤脑转移的分子标记物。本实验室前期通过反复裸鼠体内接种人肺癌细胞株PC14,筛选出肺癌特异性脑转移细胞亚株PC14/B,通过分析其生长特点、生物学活性及细胞表面因子表达,并与可以部分产生脑转移的原株及不能产生脑转移的细胞株进行比较,发现了它们之间的不同。本实验即以该细胞株为研究对象,以前述2个分子为切入点,进一步阐明脑转移的发生机制,将有助于更准确及时地对肺癌脑转移患者作出诊断,并优化其治疗方案,为肺癌防治工作打下良好的基础。目的通过对转移潜能不同的细胞株,可以部分产生脑转移的人肺腺癌细胞株PC14,肺癌特异性脑转移细胞亚株PC14/B,不能产生脑转移的肺腺癌细胞株A549进行比较,分析它们之间特定蛋白质的差异性表达及其意义,揭示肺癌脑转移的部分机制。方法分别裂解3株细胞,提取细胞总蛋白,用Bradford法进行蛋白定量;取同等量的蛋白进行非还原电泳,应用Western Blotting检测3株细胞中EGFR以及含S100B亚基蛋白的表达情况;同时应用细胞免疫组化法检测细胞中EGFR和S100B的表达情况。取同等量的细胞分别提取3株细胞的总RNA,逆转录成cDNA,利用S100B的引物分别扩增3株细胞中S100B的基因。用图像分析软件IPP （ImagePro Plus,version 6.0）比较3株细胞中EGFR和S100B的表达情况,得到的结果,用SPSS12.0进行统计学分析,组间数据用LSD? t检验进行比较,p ?0.05为差异有统计学意义。结果1.不同转移特性肺癌细胞中EGFR的表达免疫组化结果显示,3株细胞胞质及胞膜出现散在的棕黄色颗粒。A549着色最深,PC14/B和PC14着色相对较浅,各株间的染色吸光度差异具有统计学意义;Western Blotting结果可见A549中EGFR的表达明显高于PC14及PC14/B中的表达。2.不同转移特性肺癌细胞中S100B的表达RT-PCR结果表明,在转录水平上,3株细胞的含量有明显的差异,PC14/B远远高于其他两株细胞。免疫化学染色结果显示,3株肿瘤细胞A549染色阴性,PC14、PC14/B胞质均出现散在的棕黄色颗粒,且PC14/B强于PC14,细胞株间在染色强度上的差异具有统计学意义（ ）;Western Blotting结果可见在约21KD处3株细胞均有清晰条带,条带强度未见明显差异;PC14/B在约32KD及40KD处分别出现1条特异性条带,其中40KD处为高亮度,32KD处为中等亮度,在相应位置PC14及A549均未见条带产生。p?0.05结论我们的试验发现EGFR在A549中的表达明显高于PC14及PC14/B,野生型EGFR的表达则可能同肺癌的脑转移行为无明显正相关。同时发现有2种由S100B参与形成的蛋白聚合体,在PC14/B（特异性脑转移）中特异性高表达,在A549（不产生脑转移）和PC14（部分脑转移）中未见明确表达,RT-PCR的结果部分印证了Western Blotting和免疫组化。表明了肺癌的脑转移行为可能同它能够特异性地产生某些由S100B参与形成的蛋白聚合体有关,而血清或脑脊液中的S100B蛋白有可能部分来源于肿瘤细胞。

论文目录

• 缩略语表
• 中文摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 文献回顾
• 1 脑转移概述
• 2 恶性肿瘤脑转移的机制
• 3 肺癌脑转移及其机制概述
• 4 本课题相关分子的研究进展
• 正文
• 实验一 3 株肺癌细胞中EGFR含量的检测
• 1 材料
• 1.1 主要实验仪器
• 1.2 细胞株
• 1.3 主要试剂
• 1.4 溶液
• 2 方法
• 2.1 3株肿瘤细胞生长特性分析
• 2.2 3 株肿瘤细胞EGFR蛋白的表达检测
• 3 实验结果
• 3.1 3 株肿瘤细胞生长特性分析
• 3.2 肿瘤细胞EGFR蛋白的表达检测
• 4 讨论
• 实验二 3 株肺癌细胞中S100B含量的检测
• 1 材料
• 1.1 试验仪器
• 1.2 主要试剂
• 1.3 溶液
• 2 方法
• 2.1 肿瘤细胞S100B mRNA含量检测
• 2.2 肿瘤细胞S100B蛋白表达的检测
• 3 实验结果
• 3.1 S100B基因水平的含量检测
• 3.2 3 株肿瘤细胞S100B蛋白的表达检测
• 4 讨论
• 小结
• 参考文献
• 个人简历和研究成果
• 致谢