金银花内生真菌的分离鉴定和分子系统学研究

论文摘要

目的:对金银花内生真菌进行了分离鉴定和分子系统学分析,为金银花内生真菌的种属鉴别和资源的开发利用提供科学的依据,并为下一步深入研究金银花内生真菌的药用价值提供理论基础。方法:1采用组织块法对金银花内生真菌进行分离并纯化。2采用形态学方法对内生真菌进行初步鉴定。3利用分子生物学方法对分离出的四株菌种进行ITS序列测定,应用GenBank中Blast程序进行相似性分析。4应用聚类分析软件clustalx进行序列分析并且计算进化距离,构建系统发育树。结果:1通过分离纯化得到了四株纯菌种,编号分别为JYH1、JYH2、JYH3、JYH4,并进行了初步鉴定。2得到了四株菌种的内转录间隔区ITS序列,通过对比并依据形态学,鉴定出JYH1与黄绿木霉同源性达到了99%,可断定为木霉属、JYH2与马尔尼菲青霉菌同源性达到了99%,可断定为青霉属、JYH3与茶藨子叶状层菌同源性达到97%,可以断定为叶状层菌属、JYH4交枝顶孢霉同源性达到了99%,可断定为枝顶孢霉属。3从GenBank中下载所分离鉴定的四株菌近缘属的14条序列被用作系统发育分析,构建系统树,分析其亲缘关系,结果显示金银花内生真菌具有多样性。结论:1研究证明用分子生物学方法通过测定ITS序列对金银花内生真菌进行鉴定方法准确可行有效。2研究证明茶藨子叶状层菌属于Phylloporia属,且与Phellinus属亲缘关系较近。3本实验分离得到的菌株具有较高的利用价值,为下一步的深入研究奠定基础。

论文目录

• 提要
• Abstract
• 引言
• 第一部分 文献综述
• 1 药用植物内生真菌的概念及其研究概况
• 1.1 药用植物内生真菌的多样性
• 1.2 药用植物内生真菌与宿主的关系
• 1.3 药用植物内生真菌次生代谢产物的多样性
• 2 金银花内生真菌研究进展
• 3 药用真菌的研究概况
• 4 茶藨子叶状层菌Phylloporia ribis
• 5 Phellinus 属与Phylloporia 真菌的分类历史及系统发育研究进展
• 6 真菌分子生物学鉴定方法简介
• 6.1 DNA 碱基组成分析
• 6.2 DNA 分子杂交技术
• 6.3 限制性片段长度多态性分析
• 6.4 随机扩增多态性DNA 标记
• 6.5 微卫星DNA 指纹图谱技术
• 6.6 核酸序列分析
• 7 系统发育树主要的构建方法
• 7.1 距离法
• 7.2 最大简约法
• 7.3 最大似然法
• 第二部分 茶藨子叶状层菌生药学研究
• 1 种名鉴定
• 2 形态结构
• 3 一般生长习性
• 4 鉴别
• 4.1 性状鉴别
• 4.2 显微鉴别
• 4.3 一般理化鉴别
• 4.4 薄层色谱鉴别
• 5 茶藨子叶状层菌在植株上的寄生规律
• 5.1 茶藨子叶状层菌寄生与植株生长年限的关系
• 5.2 茶藨子叶状层菌寄生与植株品种之间的关系
• 5.3 叶状层菌寄生与植株叶片生长情况的关系
• 5.4 叶状层菌寄生与植株枝条生长情况的关系
• 5.5 叶状层菌寄生植株与其花蕾重量（20 个花重克数）的相关性
• 第三部分 金银花内生真菌的分离纯化及其初步鉴定
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 仪器和设备
• 1.3 试剂
• 1.4 培养基的制备
• 2 分离纯化
• 2.1 样品表面消毒及预处理
• 2.2 菌种的分离与纯化
• 3 菌种的形态学鉴定
• 3.1 菌落的形态观察
• 4 菌种的保存
• 5 结果分析
• 第四部分 基于ITS 序列分析的分子系统发育研究
• 1 实验材料
• 1.1 供试菌株
• 1.2 培养基及配方
• 1.3 主要实验仪器
• 1.4 试剂准备
• 2 实验方法
• 2.1 菌种的保藏
• 2.2 菌体的培养收集以及预处理
• 2.3 菌体总DNA 的提取
• 2.4 PCR 反应体系、步骤及扩增的引物
• 2.5 PCR 扩增产物的回收与纯化
• 2.6 目的片段的测序
• 3 结果与分析
• 3.1 菌种凝胶电泳检查
• 3.2 实验测得的各菌株ITS 序列碱基
• 3.3 利用GenBank（Blast）对比法分析金银花内生真菌的种属
• 3.4 金银花内生真菌的系统发育分析
• 3.5 结果与讨论
• 全文结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的论文
• 详细摘要