拟南芥蛋白质的互作机制及桑树同源基因功能的研究

论文题目: 拟南芥蛋白质的互作机制及桑树同源基因功能的研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 特种经济动物饲养

作者: 沈国新

导师: 楼程富

关键词: 拟南芥,桑树,蛋白质互作,叶绿体蛋白酶,基因功能

文献来源: 浙江大学

发表年度: 2005

论文摘要: 植物学的研究已进入后基因组时代。基因组测序计划鉴定出大量的有待明确其功能的基因。一项研究蛋白质互作作图的重要技术是酵母双杂系统。这项技术的应用,需要一系列酵母菌及大肠杆菌转化,而后在营养缺陷型培养基上筛选阳性克隆。该技术1989年问世,在短短的10余年时间内,已成了研究蛋白质互作的重要手段,并揭示了生命体内大量的蛋白质互作关系。 拟南芥基因AtCHIP是一个与动物(人类、老鼠)基因CHIP有相似结构、功能和非常高的碱基同源性的植物基因,被证明是E3结合蛋白酶,参与泛素-蛋白酶体系的蛋白质降解作用。AtCHIP表现出与植物逆境胁迫如高温、低温、高盐的应答有关。为进一步探索AtCHIP的功能及其机理。本文以AtCHIP为研究对象,利用酵母双杂系统,从拟南芥cDNA文库中筛选与之有相互作用的蛋白质,从而进一步研究了其互作基因的功能。研究得到了以下主要结果。 1.利用酵母双杂技术,筛选得到了1036个与AtCHIP有互作的候选克隆,经营养缺陷型培养基筛选,共获得了111个阳性克隆,对质粒DNA进行了测序,测序结果提交拟南芥genebank分析,有29种蛋白与AtCHIP有相互作用(同源性达98%以上),有12种基因序列未在genebank中找到同源序列,可能为新的拟南芥基因。AtCHIP互作蛋白中重复频率最高的有UBC家属酶蛋白,Htransporting ATP synthesizing chain 9,叶绿体蛋白酶等。 2.证实了AtCHIP与缀合酶E2及泛素分子有专一性的互作关系。在已经被证实的40种拟南芥缀合酶E2中,UBC8、UBC9和UBC10 3种与AtCHIP有互作关系;同样,在已发现的15种泛素分子中,UBQ1、UBQ5二种与AtCHIP有互作关系。证明AtCHIP的这种互作关系是一种特导性的反应。 3.生物体外试验证实叶绿体蛋白酶Clpe4,FtSH1是以AtCHIP为E3的泛素-蛋白酶体系的底物。首先,利用PET系统,成功地表达了AtCHIP,UBC8,ClpP4等3个基因的蛋白质,并加以提纯。以此为材料进行了泛素化体外反应试验,以AtCHIP为E3,UBC8为E2,ClpP4为底物的体外反应试验结果表明,至少有3个泛素分子被结合到ClpP4分子上。 4.生物体内分子生物学检测(Western Blot)也证实ClpP4,FtSH1是AtCHIP

论文目录:

致谢

中文摘要

前言

第一部分 文献综述

第一章 蛋白质组的研究与酵母双杂交技术

1.蛋白质组的研究

1.1 蛋白质组学研究的主要领域

1.2 蛋白质组学研究技术

2.酵母双杂技术综述

2.1 酵母双杂技术

2.2 酵母双杂技术在蛋白质互作研究中的应用

2.3 酵母双杂技术所用的主要质粒与菌种

第二章 分子生物学研究的模式植物拟南芥及若干基因的研究现状

1.拟南芥的研究现状

1.1 研究历史

1.2 研究现状

1.3 拟南芥中与逆境(温度、水分、盐分)有关基因研究现状

2.拟南芥基因AtCHIP作为E3连接酶的结构与功能研究

2.1 动物中同源基因CHIP的研究

2.2 植物基因AtCHIP的研究现状

3.叶绿体蛋白酶基因的研究现状

3.1 主要蛋白酶基因

3.2 叶绿体中蛋白酶的分布示意图

第三章 泛素-蛋白酶体系及蛋白质调控

1.泛素-蛋白酶体系

1.1 泛素

1.2 泛素-蛋白酶体系中的主要酶(体)

1.3 蛋白酶体(proteasome)

2.泛素-蛋白酶体系与蛋白质降解

第四章 桑树遗传和生物工程的研究与应用进展

1.桑树的遗传资源及其利用

1.1 桑树种质资源及遗传育种

1.2 细胞工程及在桑树育种中的应用

2.桑树的基因工程

2.1 供转化的基因

2.2 转化途径

2.3 桑树转基因研究现状与进展

2.4 桑树转基因技术存在的问题

3.桑树基因的分离和利用现状

3.1 植物基因克隆技术

3.2 桑树等木本植物分子标记和基因克隆

第二部分 材料与方法

第五章 材料与方法

1.材料

1.1 植物材料及处理

1.2 主要质粒与酵母菌菌种

1.3 大肠杆菌质粒与菌株

2.方法

2.1 质粒的构建

2.2 拟南芥cDNA文库的滴定

2.3 酵母菌感受态细胞的制备，转化及质粒DNA的提取，纯化

2.4 大肠杆菌感受态细胞的制备，转化及质粒DNA的提取，纯化

2.5 AtCHIP互作基因(猎物基因)的筛选

2.6 酵母菌双杂技术中假阳性克隆的排除

2.7 AtCHIP互作基因DNA序列结果分析

2.8 PET系统及质粒的构建，蛋白质的表达和提取

2.9 PET系统表达蛋白的纯化

2.10 体外泛素—蛋白质结合试验和检测

2.11 AtCHIP转基因植株逆境下若干互作蛋白和相关蛋白质的的消长

2.12 用基因过量表达，反义技术研究AtCHIP互作基因ClpP4的功能

2.13 用基因过量表达，反义技术研究AtCHIP互作基因的功能

2.14 桑树基因AtNHX1的克隆及拟南芥的转化

3.研究思路与技术路线

第三部分 结果与分析

第六章 酵母双杂技术研究拟南芥基因AtCHIP的蛋白质互作基因

1.拟南芥cDNA文库滴定

1.1 滴定结果

1.2 候选阳性克隆的初次筛选

2.阳性“猎物”克隆的筛选

2.1 酵母菌质粒DNA转化大肠杆菌KC8

2.2 KC8质粒DNA的提取，转化

3.假阳性克隆的排除

3.1 回转试验结果

3.2 β-半乳糖培养基筛选

4.阳性克隆DNA测序及分析

4.1 供测序的阳性克隆DNA

4.2 测序结果与拟南芥Genebank分析

第七章 AtCHIP若干互作基因的蛋白质表达及体外泛素—蛋白质结合试验

1.蛋白质表达质粒构建，大肠杆菌BL21转化

2.目标蛋白的诱导，提取，纯化

3.AtCHIP作E3连接酶的泛素化作用及测验

4.AtCHIP在逆境胁迫下蛋白互作中的位置分析

第八章 AtCHIP转基因植株逆境下若干互作蛋白的消长

1.AtCHIP过量表达植株正常条件下Clp的蛋白质

2.AtCHIP过量表达植株低温处理下Clp的蛋白质

3.AtCHIP过量表达植株高温处理下Clp的蛋白质

4.AtCHIP若干互作基因在植物光合修复中的作用

4.1 植物光损伤后的酶修复体系

4.2 AtCHIP过量表达植株强光处理下的表型及Clp、Deg和FtsH的蛋白质

4.3 AtCHIP过量表达植株强光处理下D1蛋白质与AtCHIP的调控

第九章 AtCHIP互作基因ClpP4的功能研究

1.ClpP4基因敲除植株的鉴定

2.ClpP4基因敲除后植株的表型

3.ClpP4基因过量表达及反义转基因植株的鉴定

3.1 转基因植株的PCR鉴定

3.2 转基因植株的Northern Blot鉴定

3.3 转基因植株的Western Blot鉴定

4.ClpP4基因过量表达及反义转基因植株的表型

第十章 桑树(Morus alba Linne)基因mNHX1的克隆及其功能研究

1.桑树基因NHX1的克隆

1.1 RT-PCR法合成桑芽cDNA

1.2 PCR扩增桑芽基因mNHX1 cDNA

1.3 mNHX1的克隆、鉴定

2.桑树基因mNHX1转拟南芥植株的鉴定

2.1 转基因植株纯系

2.2 转基因植株的PCR鉴定

3.拟南芥转基因植株的表型

3.1 盐浓度与转基因种子发芽率

3.2 盐浓度与转基因植株的生长

第十一章 讨论与结论

1.讨论

1.1 酵母菌双杂技术的实践与应用

1.2 翻译后蛋白调控

1.3 AtCHIP互作蛋白UBQ1、UBQ5—泛素因子

1.4 AtCHIP互作蛋白UBC8、UBC9和UBC10—泛素缀合酶蛋白E2

1.5 AtCHIP互作蛋白ATP依赖性Clp蛋白酶，FtSH蛋白酶

1.6 AtCHIP是蛋白分解系统原核生物向真核生物发展的一个实例

2.结论

参考文献

英文摘要

附录

附录1.试剂、缓冲液和培养基的配制及主要仪器设备

附录2.主要质粒构图

附录3.博士期间形成的主要学术论文目录

发布时间: 2005-07-27

参考文献

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