论文摘要
目的通过真核表达载体pCMV-tag2B将HPV16 E7基因导入人永生化表皮细胞HaCaT,建立稳定表达HPV16 E7的HaCaT-E7细胞系,探讨HPV16 E7癌基因对HLA-Ⅰ类分子表达的影响及相关机制。方法1.稳定表达HPV16 E7 HaCaT细胞系的建立取对数生长期的HaCaT细胞,分别转染pCMV-E7、pCMV-tag2B质粒及设立空白对照组。500ug/ml G418筛选21天后,空白对照组的正常细胞全部死亡,转染组挑选阳性克隆,扩大培养,建立稳定转染HPV16 E7的细胞系HaCaT-E7及空载体对照细胞系HaCaT-pCMV。2.HaCaT-E7细胞系的鉴定取对数生长期正常HaCaT细胞、HaCaT-E7细胞、HaCaT-pCMV细胞,TRIZOL法提取细胞总RNA,以OligdT引物将RNA逆转录为cDNA,以管家基因β-actin为内参照,实时荧光定量PCR检测HPV16E7 mRNA的表达;分别提取正常HaCaT细胞、HaCaT-E7细胞、HaCaT-pCMV细胞总蛋白,经SDS-聚丙稀酰胺（SDS-PAGE）蛋白电泳,Western Blot检测HPV16E7蛋白的表达。3.流式细胞术检测细胞膜表面HLA-Ⅰ类分子的表达取对数生长期正常HaCaT细胞、HaCaT-E7细胞、HaCaT-pCMV细胞,0.25%胰酶消化,含1%牛血清白蛋白的PBS（BSA,PBS-B）调整细胞浓度为107 cells/ml。取100μl细胞悬液,加入20ul抗HLA-ABC-FITC或抗KLH-FITC（同型对照）,混匀后避光静置20min,PBS-B冲洗两遍,400μl PBS-B重悬,上机检测。同理用抗CD46-FITC检测细胞膜表面CD46,做为阳性对照。4.两步法实时荧光定量PCR检测HLA—ⅠmRNA的表达取对数生长期正常HaCaT细胞、HaCaT-E7细胞、HaCaT-pCMV细胞,TRIZOL法提取细胞总RNA,以OligdT引物将RNA逆转录为cDNA。以管家基因β-actin为内参照,实时荧光定量PCR检测HLA-A、HLA-B、HLA-C mRNA的表达。反应结束得到各个基因的循环阈值（Ct值）,用相对定量的方法(2-ΔΔCT)来分析各个基因mRNA表达的改变。结果1.转染HPV16 E7后,500ug/ml G418筛选21天,出现单细胞克隆。实时荧光定量PCR检测HaCaT-E7组细胞HPV16 E7 mRNA的表达,HPV16 E7与内参照β-actin相差约13.27±0.86个循环。扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳,扩增片段约93bp,与HPV16 E7目的片段相符。Western Blot结果显示,HaCaT-E7组细胞在17KD处检测到HPV16 E7蛋白的表达,与Caski细胞系所表达的HPV16E7位置一致,证实HPV16 E7蛋白在HaCaT-E7细胞中稳定表达,HaCaT-E7细胞系构建成功。2.流式细胞术检测正常HaCaT组、HaCaT-pCMV组、HaCaT-E7组细胞表面HLA-ABC:三组细胞平均荧光强度依次为357.65±15.65、346.82±16.77、182.16±16.47。HaCaT-E7组比正常HaCaT组和HaCaT-pCMV组HLA-ABC的表达显著下降,差异有统计学意义（P＜0.001）。CD46分子表达于人类所有细胞膜表面,其在三组细胞中的表达差异没有统计学意义,表明HPV16 E7癌基因的导入对其它膜表面分子的表达没有影响,HaCaT-E7组细胞HLA-ABC的下降是特异性的。3.实时荧光定量PCR检测正常HaCaT组、HaCaT-pCMV组、HaCaT-E7组细胞HLA-A、B、C mRNA的表达:2-ΔΔCT法计算出各个基因针对内参照β-actin的相对表达量,A、B、C三个位点在HaCaT-E7组的表达与正常HaCaT组及HaCaT-pCMV组相比,差异均无统计学意义（HLA-A,P=0.954;HLA-B,P=0.781;HLA-C,P=0.821）。结论1.通过真核表达载体pCMV-tag2B将HPV16 E7基因导入人永生化表皮细胞HaCaT,成功建立了稳定表达HPV16 E7的人永生化表皮细胞系。2.转染HPV16 E7后,G418筛选21天,细胞膜表面HLA-Ⅰ类分子表达特异性显著降低。3.HLA-Ⅰ类分子表达降低的HaCaT-E7细胞系,其胞内HLA-A、B、C mRNA均未下降,HPV16 E7导致膜表面HLA-Ⅰ类分子表达降低发生在转录后的装配过程。
论文目录
相关论文文献
- [1].HLA基因与复发性流产相关性的研究进展[J]. 重庆医学 2020(05)
- [2].HLA基因在子痫前期中的研究进展[J]. 医学理论与实践 2020(09)
- [3].HLA基因多态性与特应性皮炎相关性研究[J]. 中国处方药 2020(09)
- [4].基于HLA的机载武器仿真系统框架设计及实现[J]. 微型机与应用 2017(04)
- [5].一种基于HLA的交会对接动力学仿真系统设计与实现[J]. 科技创新与应用 2017(13)
- [6].HLA半相合表位构象分析技术在治疗免疫性血小板输注无效中的一次成功应用[J]. 临床血液学杂志(输血与检验) 2017(03)
- [7].免疫学参数HLA与腹腔子宫内膜异位症病因学关系[J]. 黑龙江医药科学 2014(06)
- [8].232例终末期肾功能衰竭患者HLA基因多态性分析[J]. 实验与检验医学 2015(04)
- [9].肾综合征出血热与HLA基因多态性相关性研究进展[J]. 热带病与寄生虫学 2020(02)
- [10].HLA基因多态性与生殖系统疾病及不良妊娠关系的研究进展[J]. 医学综述 2020(12)
- [11].乙型肝炎病毒相关性肝癌患者HLA-Ⅰ基因多态性分布特征研究[J]. 重庆医学 2020(16)
- [12].HLA基因多态性与非典型抗精神病药物性肝损伤关联性研究[J]. 精神医学杂志 2016(05)
- [13].奥卡西平诱发轻微皮肤不良反应与HLA等位基因相关性的研究[J]. 黑龙江医药科学 2016(01)
- [14].HLA-Ⅰ类分子在黑素瘤中的表达[J]. 中国麻风皮肤病杂志 2012(08)
- [15].HLA全相合异基因造血干细胞移植治疗骨髓纤维化患者的护理体会[J]. 当代护士(下旬刊) 2014(04)
- [16].药源性肝损害与HLA基因多态性的相关性研究进展[J]. 中国药学杂志 2014(10)
- [17].一种基于HLA的机载预警雷达训练模拟器设计[J]. 信息化研究 2014(03)
- [18].基于HLA的感知雷达任务规划[J]. 企业导报 2014(11)
- [19].HLA半相合非清髓造血干细胞移植并发慢性重叠型移植物抗宿主病1例[J]. 河北医药 2012(19)
- [20].血小板输注无效患者HLA及抗-HLA表达[J]. 中国输血杂志 2012(09)
- [21].血小板输注无效患者中HLA抗原抗体表达的研究[J]. 中国输血杂志 2012(11)
- [22].HLA相合同胞异基因外周血造血干细胞移植治疗急性白血病[J]. 中国组织工程研究与临床康复 2011(27)
- [23].幼年特发性关节炎与HLA基因相关性研究进展[J]. 临床儿科杂志 2010(02)
- [24].反复自然流产患者主动免疫治疗后血清HLA抗体的变化及意义[J]. 中国优生与遗传杂志 2010(04)
- [25].裸鼠体内培养对腺垂体HLA-Ⅱ表达的影响[J]. 山东医药 2010(42)
- [26].基于HLA的分布交互仿真系统体系结构研究[J]. 山东轻工业学院学报(自然科学版) 2010(04)
- [27].HLA单倍体外周血联合骨髓干细胞移植治疗急性混合细胞白血病的临床观察[J]. 重庆医学 2009(05)
- [28].基于HLA和网络服务的协同仿真环境[J]. 计算机应用与软件 2009(11)
- [29].基于HLA的态势显示系统研究[J]. 测绘科学技术学报 2008(06)
- [30].HLA基因与原发性高血压的相关性研究[J]. 中国慢性病预防与控制 2008(01)