论文摘要
目的:肌球蛋白轻链激酶（myosin light chain kianse, MLCK）是调节平滑肌收缩的关键酶。通常情况下,在Ca2+和钙调蛋白（calmodulin, CaM）存在时,MLCK磷酸化肌球蛋白20KD的调节轻链（MLC20）,进而增加肌球蛋白（myosin）Mg2+-ATP酶活性,使肌球蛋白与肌动蛋白（actin）之间发生相互作用,引起肌肉收缩,这是调节平滑肌收缩的经典途径。MLCK作为一种多功能的调节蛋白,除具有磷酸化MLC20的激酶活性外,还具有与肌球蛋白和肌动蛋白结合的非激酶活性。有研究表明,MLCK的非激酶活性在平滑肌的收缩中也起一定的作用。为了更好的研究MLCK的非激酶活性,本实验利用牛胃重组全长野生型MLCK,对其1002-1022氨基酸（即CaM结合位点）进行定点突变,使牛胃MLCK cDNA序列中的T3016、G3017、A3052、G3053、A3054、C3055、T3056突变为G3016、C3017、G3052、C3053、G3054、G3055、C3056,在氨基酸水平上Trp1006、Arg1018、Leu1019将被突变为Ala。并利用大肠杆菌表达系统成功地进行了大量表达,经纯化获得了重组的MLCK突变体。检测了重组MLCK突变体对肌球蛋白的Mg2+-ATP酶活性的影响、MLCK突变体与肌动蛋白的结合的活性以及对体外肌丝运动的影响,进一步证明了MLCK的非激酶活性在平滑肌收缩过程中的调节作用。方法:根据牛胃重组全长野生型MLCK的cDNA序列设计两条突变引物,通过PCR反应进行定点突变。在大肠杆菌中表达重组全长野生型MLCK（WT/MLCK）和CaM结合位点突变型MLCK（ΔCaM/MLCK）,通过亲和层析及凝胶过滤进行分离纯化。SDS-PAGE检测表达及纯化的重组蛋白。Glycerol-PAGE检测重组MLCK对MLC20的磷酸化水平。孔雀绿方法检测重组MLCK突变体对肌球蛋白的Mg2+-ATP酶活性的影响。蛋白结合实验检测Ca2+/CaM对重组MLCK与肌动蛋白结合活性的影响。体外肌丝运动实验（in vitro motility assay）检测重组MLCK对肌动蛋白肌丝运动速度的影响。结果:测序结果显示成功构建了牛胃重组MLCK钙调蛋白结合位点突变体（ΔCaM/MLCK）。ΔCaM/MLCK可以在大肠杆菌中以可溶形式大量表达,经CaM-Sepharose 4B和Superose 6 HR纯化、SDS-PAGE鉴定得到较纯的单一条带。Glycerol-PAGE显示重组全长野生型MLCK（WT/MLCK）具有磷酸化MLC20的激酶活性,并随着MLCK浓度的增加MLC20的磷酸化水平也逐渐增加,ΔCaM/MLCK则失去了磷酸化MLC20的激酶活性。孔雀绿方法测得的酶活性结果为:在无Ca2+/CaM存在时,随着ΔCaM/MLCK浓度的增加,非磷酸化肌球蛋白的Mg2+-ATP酶活性明显增加;而磷酸化肌球蛋白的Mg2+-ATP酶活性明显降低。结合实验结果表明:WT/MLCK和ΔCaM/MLCK都具有与肌动蛋白结合的能力;Ca2+/CaM可以部分阻断WT/MLCK和肌动蛋白的结合（P<0.05）,而Ca2+/CaM对ΔCaM/MLCK和肌动蛋白结合的影响不大（P>0.05）。体外运动实验结果显示:无Ca2+/CaM存在时,WT/MLCK和ΔCaM/MLCK均抑制肌动蛋白肌丝的运动（P<0.01）;有Ca2+/CaM存在时,WT/MLCK对肌动蛋白肌丝的运动影响不大,而ΔCaM/MLCK对肌动蛋白肌丝的运动则有明显抑制作用（P<0.01）。结论:本实验得到如下结论:1.通过定点突变获得重组MLCK钙调蛋白结合位点突变体（ΔCaM/MLCK）并可以在大肠杆菌中以可溶形式大量表达;经亲和层析和凝胶过滤获得较纯的重组MLCK。2.ΔCaM/MLCK失去了磷酸化肌球蛋白20KD调节轻链的激酶活性。3.通过重组突变型MLCK（ΔCaM/MLCK）对肌球蛋白Mg2+-ATP酶活性的影响表明MLCK具有非激酶活性。在无Ca2+/CaM条件下,激活非磷酸化肌球蛋白的Mg2+-ATP酶活性;抑制磷酸化肌球蛋白的Mg2+-ATP酶活性。4.结合实验结果表明:Ca2+/CaM通过MLCK的1002-1022位氨基酸（CaM结合位点）影响了MLCK与肌动蛋白的结合。5.由体外运动实验结果推测Ca2+/CaM是通过MLCK的1002-1022位氨基酸（CaM结合位点）影响MLCK与肌动蛋白的结合,进而调节了肌动蛋白与肌球蛋白的相互运动。
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