小鼠生精细胞T型Ca2+通道和ENaC的研究

论文摘要

受精是一种精确调节的细胞间相互作用事件。配子在各自的性腺中产生，并且部分成熟，随后经过获能和顶体反应等过程，精子和卵子融合产生一个新的个体。众多研究表明离子通道与雄性哺乳动物生精及受精等生殖过程关系密切。其中ENaC和T型Ca2+通道在哺乳动物精子获能和顶体反应等功能中起重要作用。本文采用全细胞膜片钳技术记录并鉴定了小鼠生精细胞上的离子通道：T型Ca2+通道和ENaC，并且进一步研究微量元素和雌激素对两种通道的作用。小鼠生精细胞Ca2+电流呈现如下的特性：-60 mV时激活，-20 mV时达到最大值，翻转电位约为+40 mV；半数激活电压(Vα1／2)为（-48．23±1．29）mV，激活斜率因子（Kα）为（7．93±0．99）mV；半数失活电压(Vi1／2)为（-58．33±0．83）mV，失活斜率因子（Ki）为（5．0±0．62）mV；峰电流时间常数tp和失活时间常数τh呈电压依赖性减小，常数改变e倍，电压分别改变11．02 mV、13．73 mV；通道去激活时间常数τd>1ms，且呈电压依赖性增加；二价无机阳离子对Ca2+电流的抑制作用Ni2+>Cd2+；通道Ba2+的选择性与Ca2+相似；以上特性都符合T型Ca2+通道的特征，证明我们在小鼠生精细胞上所记录到的电流为T型Ca2+电流。此外利用步阶电压和斜坡电压分别记录并鉴定了ENaC电流。利用不同的电流记录外液研究ENaC的离子通透选择性，结果显示在标准记录外液中可以记录到标准的ENaC电流以及斜坡电流；将外液换成不含Na+和K+的溶液（ACh+），几乎记录不到电流及其斜坡电流；换成K+外液同样也记录不到明显的ENaC电流。因此ENaC的离子通透性为：Na+>>K+=ACh+。加入特异性的阻断剂，我们发现Amiloride（Ami）能够浓度依赖性地抑制ENaC电流。以上特性足可以证明实验记录到的电流是ENaC电流。通过统计发现小鼠生精细胞上存在两种Amiloride敏感性的ENaC，其中敏感型ENaC的Ami IC50约为1μmol·L-1；另外，还发现一组Ami非敏感性ENaC，加入10μmol·L-1的Amiloride，ENaC电流的抑制率只有30％左右。而且敏感型ENaC电流尾部有一内向成份，通过分析初步认为是一T型Ca2+电流。据此判定小鼠精子上同样存在两种Ami敏感的ENaC通道从而执行不同的精子功能。研究表明，微量元素与性功能、性激素分泌和生殖系统的病变密切相关。现在普遍认为锌、铅、铜三种微量元素与性功能、性激素分泌、生殖系统的关系最为密切，其机制缺乏研究。其中锌和铅对小鼠生精细胞T型Ca2+通道的作用本实验室已有报道。目前普遍认为Cu2+能够抑制小鼠精子的运动，但是其作用机制还不明确。运用全细胞膜片钳技术观察铜对小鼠生精细胞T型Ca2+通道和ENaC通道的作用，从而推测铜对哺乳动物精子获能和顶体反应等生殖功能影响的可能机制。结果提示Cu2+能够浓度依赖性地抑制小鼠生精细胞T型Ca2+通道，Cu2+（0.3，1，3，10，30）μmol·L-1对钳制电位为-90 mV，刺激电压为-20 mV时Ca2+电流的抑制率分别为（9．32±0．74）％，（18．40±1．03）％，（33．60±1．73）％，（49．59±4．13）％，（59．96±3．60）％（P<0．05）。且Cu2+对T型Ca2+电流的抑制作用呈非电压依赖性，半数抑制浓度IC50为12．06μmol·L-1。10μmol·L-1Cu2+作用后，T型Ca2+通道的激活曲线和失活曲线均向超极化方向轻微移动2 mV左右（P>0．05）；峰电流时间常数tp、失活时间常数τh和去激活时间常数τd均减小；而复活时间常数τr增大。由于小鼠生精细胞存在两种ENaC电流，因此实验分别观察了Cu2+对两种ENaC的作用。结果显示Cu2+对不敏感型ENaC电流没有作用；而对于敏感型ENaC电流，Cu2+能够浓度依赖性地抑制其电流。Cu2+（0．1，1，10）μmol·L-1对小鼠生精细胞敏感型ENaC电流抑制率分别为（8．13±2．55）％，（22．25±2．28）％，（41．11±2．58）％（P<0．05）。且Cu2+对敏感型ENaC电流的抑制作用也呈非电压依赖性。Cu2+对敏感型ENaC电流尾部内向电流的抑制作用同样证实了其为T型Ca2+通道电流。17β-雌二醇（E2）作为一种主要的雌性激素，在女性生殖功能中具有重要的作用。近年来的研究发现，E2在男性生殖功能中也同样具有调节效应。Saberwal GS等发现E2可通过引起胞内钙离子浓度的变化而影响大鼠精子的活力和AR，雌激素拮抗剂可改变与大鼠精子运动相关蛋白的活性。E2对精子[Ca2+]i升高作用的机制至今尚未阐明，是否通过T型Ca2+通道起作用还不明确。E2是否影响小鼠精子获能过程中超极化过程，对相关的ENaC作用如何，目前尚无人研究。利用全细胞膜片钳技术观察了E2对小鼠生精细胞T型Ca2+通道和ENaC的作用，进而推测E2对哺乳动物精子生殖功能的作用机制。E2（1，10，100）μmol·L-1浓度依赖性地抑制小鼠生精细胞T型Ca2+电流，抑制率分别为（13．48±1．86）％，（28．98±2．70）％和（52．93±3．42）％（P<0．05），且E2对T型Ca2+电流的抑制作用呈电压依赖性，随着电压升高抑制率增加。E2对T型Ca2+通道的半数最大抑制浓度K50为8．89μmol·L-1。100μmol·L-1处理之后，激活和失活曲线均显著的向超极化方向移动5 mV左右（P<0．05）；T型Ca2+通道电流密度显著降低，并且向超极化方向移动，峰电流电压同样左移；峰电流时间常数tp、失活时间常数τh和去激活时间常数τd均减小；复活时间常数τr增大。对于小鼠生精细胞的两种ENaC，统计了20个细胞发现E2对两种不同的通道均没有作用。而E2对敏感型ENaC电流尾部内向电流的抑制也充分证明了该内向电流为T型Ca2+通道电流。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 引言
• 2+通道的生理研究'>第一部分 小鼠生精细胞T型Ca²⁺通道的生理研究
• 第一节 小鼠生精细胞的获得及鉴定
• 2+通道的记录及鉴定'>第二节 小鼠生精细胞T型Ca²⁺通道的记录及鉴定
• 2+通道的作用'>第三节 微量元素铜对小鼠生精细胞T型Ca²⁺通道的作用
• 2+通道的作用'>第四节 17β-雌二醇对小鼠生精细胞T型Ca²⁺通道的作用
• 第二部分 小鼠生精细胞上皮钠通道（ENaC）的生理研究
• 第一节 小鼠生精细胞ENaC通道的记录及鉴定
• 第二节 微量元素铜对小鼠生精细胞ENaC的作用
• 第三节 17β-雌二醇对小鼠生精细胞ENaC的作用
• 小结
• 参考文献
• 致谢
• 综述
• 附录:发表论著