论文摘要
目的喉癌在全球男性恶性肿瘤中位居第11位,占头颈部恶性肿瘤的35.4%,其中95%以上为鳞状细胞癌,发病率有明显的增长趋势。近年来欧美发表的诸多研究成果显示,中晚期喉癌患者经过放疗和化疗的联合治疗后,病情的局部控制和治愈率均接近手术和术后放疗的联合治疗方案,而且化放疗联合治疗方案较包括手术的治疗方案更能够保全器官和功能,逐渐成为中晚期喉癌的标准治疗方法之一。喉癌的化疗药物以顺铂为主,但缓解率不超过40%～70%,完全缓解者尚不足1/5,需要进一步发现并筛选更加有效的生物靶向化疗药物。信号转导子和转录激活子（signal transducers and activators of transcription,STATs）是1992年研究干扰素诱导基因转录时首次鉴定的一个胞浆蛋白家族,是根据它们在信号转导中的作用来命名的,它们接收特异细胞表面受体的信号以诱发细胞内的转录改变。迄今为止,人们已经确认了7种不同的STAT分子,包括STAT1,2,3,4,5a,5b和6。STAT3是其重要成员,具有强烈的抑制细胞凋亡、促进细胞增殖的作用,参与了人类恶性肿瘤的发生和发展。STAT3在许多人类肿瘤中活化。近年来,以STAT3为靶点的治疗措施取得了很大进展,通过直接或间接阻断STAT3信号通路抑制肿瘤细胞和异种移植瘤的STAT3活化,抑制瘤细胞增殖,促进凋亡。葫芦素（Cucurbitacins）是从葫芦科及其它科属多种植物中提取的成分,至今已发现40多种,具有多种生物活性。以葫芦素B（Cucurbitacin B,CuB）、E应用最广。近年来的许多研究表明,葫芦素B、D、E、I、Q等是JAK/STAT3信号通路的特异抑制剂,能降低多种癌细胞的STAT3活化水平,并降低STAT3的DNA结合能力和STAT3介导的基因转录,抑制肿瘤细胞增殖,诱导肿瘤细胞凋亡,抑制异种移植瘤生长。本研究首先检测了STAT3的活化形式磷酸化STAT3（p-STAT3）在喉鳞状细胞癌（laryngeal squamous cell carcinoma,LSCC）中的表达并探讨其意义,然后研究葫芦素B单独或联合多西紫杉醇（taxotere,TXT）对LSCC细胞系的体内外抑制作用,并探讨其机理。材料和方法1、选取杭州师范大学附属医院耳鼻咽喉科2004年9月-2007年8月间手术切除的56例喉鳞状细胞癌和30例正常喉黏膜组织,应用免疫组化方法检测p-STAT3的表达情况。2、用不同浓度的葫芦素B作用于Hep-2细胞不同时间,倒置显微镜观察细胞形态改变,MTT法检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞周期分布和细胞凋亡率,荧光显微镜观察细胞凋亡。Western Blot检测p-STAT3、cyclin B1、Bcl-2和p-ERK1/2（phospha-extracellular signal-regulated protein kinase 1/2）的蛋白表达。建立喉癌裸鼠移植瘤模型,观察葫芦素B的体内抑瘤作用。3、不同浓度葫芦素B、多西紫杉醇单独作用或联合作用于Hep-2细胞24、48和72h,MTT法检测计算细胞增殖抑制率,证明两者联合是否有协同作用。1μmol/L的葫芦素B、25nmol/L的多西紫杉醇单用或联合作用于Hep-2细胞24h,流式细胞仪PI单染检测细胞周期分布的变化,Hoechst 33258核染色荧光显微镜观察细胞凋亡,流式细胞仪Annexin V/PI双标记法检测细胞凋亡率,Western Blot检测p-STAT3、cyclin B1和Bcl-2的蛋白表达。建立喉癌裸鼠移植瘤模型,观察葫芦素B、多西紫杉醇单独或联合治疗的抑瘤效果。结果1、经免疫组化方法检测发现,在LSCC及正常喉黏膜组织中均存在着p-STAT3的表达,但在LSCC中表达较高,而在正常喉黏膜中则表达较低,差异具有统计学意义（P＜0.01）。2、免疫组化分析发现,在早期（1+2期）、分化程度高和无淋巴结转移的LSCC,p-STAT3的表达水平较低,而在晚期（3+4）、分化程度低和有淋巴结转移者表达较高,差异具有统计学意义（P＜0.01或P＜0.05）。p-STAT3的表达水平与患者性别、年龄及肿瘤原发部位无关（P均＞0.05）。3、MTT实验结果显示葫芦素B对Hep-2细胞的增殖抑制作用具有明显的剂量依赖性和时间依赖性。经ANOVA方差分析,P＜0.01。经LSD-t检验,不同剂量组之间、不同时间组之间及其与对照组之间的差异均有显著性意义（P＜0.05或＜0.01）。4、PI单染流式细胞仪检测结果显示葫芦素B导致Hep-2细胞GE/M期阻滞,同时伴有G0/G1期细胞减少,并具有剂量依赖性和时间依赖性。经ANOVA方差分析,P＜0.01。经LSD-t检验,不同剂量组之间、不同时间组之间及其与对照组之间的差异均有显著性意义（P＜0.05或＜0.01）。5、Hoechst 33258染色荧光显微镜观察发现,随着葫芦素B浓度增加和作用时间延长,细胞形态发生显著性改变,凋亡细胞明显增多,甚至出现大片细胞脱落形成细胞脱失区。6、PI单染流式细胞仪检测结果显示,随着葫芦素B浓度升高和时间延长凋亡峰逐渐升高。对照组、0.1、1和10μmol/L组的细胞凋亡率分别是2.94±0.56%、5.82±0.64%、11.47±1.68%和21.32±2.17%。经ANOVA方差分析,P＜0.01;经LSD-t检验,不同浓度组与对照组之间、各浓度组之间相比较,P＜0.01。对照组、8、12和24h组的凋亡率分别是1.92±0.42%、4.72±0.53%、9.45±2.32%和19.68±4.31%,经上述统计学分析,差异均有显著性意义（P＜0.01,图2-6）。表明葫芦素B可诱导Hep-2细胞凋亡,并呈剂量和时间依赖性。7、Westem blot结果显示葫芦素B可以时间和剂量依赖性抑制STAT3的激活,抑制细胞周期调控基因cyclin B1和抗凋亡基因Bcl-2的蛋白表达。P-ERK1/2蛋白表达随时间和浓度增加而增加。8、体内实验显示,27.5、55、110μg/Kg/d葫芦素B治疗组的肿瘤平均体积是0.31±0.03 cm3（P＜0.05）、0.24±0.02 cm3（P＜0.01）和0.15±0.01 cm3（P＜0.01）,明显小于空白脂质体对照组（0.43±0.05 cm3）。9、体外实验显示葫芦素B联合多西紫杉醇对Hep-2细胞的增殖抑制效应具有协同作用（24、48和72h三个时间点q＞1.15）。1μmol/L的葫芦素B、25nmol/L的多西紫杉醇单独作用或联合作用于Hep-2细胞24h,处于G2/M期细胞的比例由对照组的5.0±0.7%分别升高到33.2±3.3%（与对照组比较P＜0.01）、31.5土3.3%（与对照组比较P＜0.01）和41.1±4.3%（与对照组或单用组比较P＜0.01）。Annexin V/PI双标记法检测发现葫芦素B、多西紫杉醇单独或联合作用24h,细胞凋亡率分别是11.5±2.1%（与对照组比较P＜0.01）、12.3±1.5%（与对照组比较P＜0.01）和26.6±2.8%（与对照组或单用组比较P＜0.01）。Western Blot检测显示葫芦素B联合多西紫杉醇比单独应用更明显抑制p-STAT3、cyclin B1和Bcl-2的蛋白表达。10、葫芦素B联合多西紫杉醇对Hep-2的体内抑瘤实验显示,葫芦素B治疗组、多西紫杉醇治疗组和联合治疗组的肿瘤平均体积是0.22±0.03 cm3（P＜0.01）、0.19±0.02 cm3（P＜0.01）和0.11±0.01 cm3（P＜0.01）,明显小于对照组（0.44±0.05cm3）;联合治疗组明显小于单药治疗组（P＜0.01）。结论1、LSCC组织及正常喉黏膜组织中表达p-STAT3,其在LSCC组织中表达较高,而在正常喉黏膜组织中表达较低。2、p-STAT3的表达与LSCC的临床分期、恶性程度及有无淋巴结转移相关,在早期、低恶性度及无淋巴结转移的LSCC中,表达较低,在晚期、高恶性度及有淋巴结转移的LSCC中,表达较高;而与性别、年龄和肿瘤发生部位无关。3、葫芦素B可以抑制体外培养的喉鳞癌Hep-2细胞和体内裸鼠移植瘤的生长。4、葫芦素B抑制喉鳞癌Hep-2细胞的作用是通过诱导细胞G2/M期阻滞和凋亡来实现的。5、葫芦素B抑制喉鳞癌Hep-2细胞的作用机理可能是通过抑制STAT3信号通路的活化,进而抑制细胞周期调控基因cyclin B1和抗凋亡基因Bcl-2的表达。6、葫芦素B和多西紫杉醇协同抑制体外培养的喉鳞癌Hep-2细胞和体内裸鼠移植瘤的生长。7、葫芦素B和多西紫杉醇抑制喉鳞癌Hep-2细胞的作用是通过诱导细胞G2/M期阻滞和凋亡来实现的,联合应用比单药效果好。8、葫芦素B和多西紫杉醇联合应用,抑制STAT3信号通路的活化、抑制细胞周期调控基因cyclin B1和抗凋亡基因Bcl-2的表达作用明显比单药增强,但详细机理有待进一步研究。