论文摘要
日本血吸虫病（schistosomiasis）是一种严重危害人类健康的人畜共患寄生虫病。血吸虫卵沉积于肝、肠等组织中形成虫卵肉芽肿及其纤维化与疾病慢性化过程是日本血吸虫病发病的主要基础。由于病人病畜粪便中虫卵对湖州的污染，阳性钉螺的存在，造成了血吸虫病的反复再感染、导致血吸虫病传播与流行。因此，控制传染源是湖区血吸虫病重要的防治策略；阻断传播型抗卵疫苗包括抗血吸虫卵胚发育和抗雌虫生殖产卵的研究，一直是本课题组的重要攻关内容。先前研究证明，未成熟卵可溶性抗原（SIEA）及其SIEA26-28kDa组分具有明显的抗血吸虫卵胚发育和抗雌虫生殖产卵效果。2000年在卫生部专家组织的全国血吸虫抗原疫苗免疫统一检测试验中，来源于本课题组研制的抗血吸虫病天然分子疫苗（1号，主要成份为日本血吸虫未成熟卵SIEA26-28kDa组分）获得最佳动物保护效果：53.9％减雌雄合抱率和89.3％肝减卵率（参见卫生部安徽会议：专家大会报告P1-14，2000年7月）。近几年来，本室借助蛋白质组学等研究手段，对SIEA26-28kDa组分进行了深入分析。通过双向电泳和免疫印迹识别等技术手段，获得了10多个相关抗原分子，其中以66、71和73号抗原分子免疫反应最强，采用肽指纹图谱分析发现它们分别与次黄嘌吟-鸟嘌吟磷酸核糖转移酶（HGPRT）、琥珀酸脱氢酶铁硫蛋白（SDISP）和谷胱苷肽-S-转移酶（GST）相关，但是否就是SIEA26-28kDa组分中起抗血吸虫卵胚发育和抗雌虫生殖产卵的主要成分，尚需进一步鉴定。其中，GST作为血吸虫疫苗候选分子研究报道很多，除本研究组外，但尚未见到有关HGPRT和SDISP作为日本血吸虫疫苗候选分子的报道。因此，进一步深入研究SjHGPRT和SjSDISP作为日本血吸虫疫苗候选分子的潜能显得非常必要。采用美国生物技术信息中心网站（NCBI，网址：http://ncbi.nlm.nih.gov/）对SjHGPRT和SjSDISP进行搜索，发现二基因均有众多的表达序列标签（EST），但其3′端和5′端均不完整。本文拟用分子生物学等方面的技术和手段，克隆SjHGPRT和SjSDISP全长cDNA；构建目的基因（ORF）单价和二价原核重组表达质粒，对表达产物进行免疫活性、免疫保护性研究，并对目的基因在成虫中的定位和表达水平进行检测；构建目的基因真核重组质粒，通过真核重组质粒免疫及其与原核重组蛋白的联合免疫，评估其免疫保护性效果。方法：1)以日本血吸虫成虫cDNA文库作模板，以文库载体多克隆插入位点上下游邻近核苷酸序列设计的上下游引物，以目的基因对应的表达序列标签（EST）核苷酸序列设计的特异引物为引物，对目的基因不完整的5′端和3′端进行锚式PCR扩增，将扩增产物序列与对应的EST进行比对，基于重叠区，拼接获得全长cDNA。2)对所获得全长cDNA进行序列分析后，以成虫cDNA文库为模板扩增目的基因全长编码基因，构建PQE30、pGEX-4G1原核重组表达质粒和pcDNA3真核重组质粒。将原核重组质粒导入大肠杆菌中，在大肠杆菌中进行重组蛋白的表达、SDS-PAGE和Western-blot分析。用间接免疫荧光法对目的基因在虫体中的定位和表达水平进行检测。3)用重组蛋白和真核重组质粒免疫小鼠，评价二基因动物免疫保护性效果。动物实验分以下几组：对照组：佐剂（FCA）；空质粒（pcDNA3）；日本血吸虫rSjGST。实验组：原核单价重组蛋白免疫组SjHGPRT／PQE30；SjSDISP／PQE30原核二价重组蛋白免疫组SjHGPRT／pGEX-4T-1；SjSDISP／pGEX-4T-1。真核重组质粒免疫组SjHGPRT／pcDNA3；SjSDISP／pcDNA3。真、原核疫苗联合免以组（SjHGPRT／PQE30+SjHGPRT／pcDNA3）；（SjSDISP／PQE30+SjSDISP／pcDNA3）用减虫率，每克肝、粪减卵率及每雌子宫内卵减少率，对目的基因动物免疫保护性效果进行评价。结果：1．用锚式PCR扩增SjHGPRT对应的EST 5′端和3′端，分别获得大小约为160bp和600bp的DNA片段，二片段中分别有76bp和84bp与原EST重叠，表明是所需的片段，与原EST进行比对，去除重叠部分，拼接获得一条有效总长为1270bp的片段。序列分析表明，此序列最大ORF位于第17-713bp，内含696bp，编码231个氨基酸残基，起始密码子为ATG，终止密码子为TAA，终止密码子后第737bp处，有一强终止密码子TAA。编码的氨基酸序列理论分子量为26kDa，等电点为5.80。起始密码子邻近序列，-1位为C，-3位为G，符合Kozak规则。5′端有16bp的非编码区，3′端有558bp的非编码区和polyA尾。第1216bp和1236bp处分别有ATTAA和AATAA加尾信号，表明此片段为SjHGPRT全长cDNA。SjHGPRT与曼氏血吸虫、原鸡、大鼠、小鼠、中国仓鼠、野猪和人等动物的HGPRT或HPRT编码基因推导的氨基酸序列的一致性分别为83％、49％、47％、46％、46％、46％、46％。此全长cDNA序列已在GenBank登录，登录号为AY841891。SjSDISP对应的EST 5′端和3′端经锚式PCR扩增后，分别获得大小约为350bp和150bp的DNA片段，与原EST进行比对、拼接，去掉重叠部分，获得一条有效总长为1071bp的片段。序列分析表明，此序列最大ORF位于第106-942bp处，内含837bp，编码278个氨基酸残基。起始密码子为ATG，终止密码子为TGA，终止密码子后第949bp处，有另一终止密码子TGA。编码的氨基酸序列理论分子量为30kDa，等电点为8.57。起始密码子邻近序列，-3位为A，-4位为C，符合Kozak规则。5′端有105bp的非编码区，3′端有118bp的非编码区和polyA尾，第1036bp处出现ATTTAA加尾信号，同一阅读框下起始密码子前第7-9bp处有另一终止密码子TAA，表明此片段为SjSDISP全长cDNA。SjSDISP与小鼠、人、果蝇、酿酒酵母、秀丽隐杆线虫和大鼠等真核生物的SDISP编码基因推导的氨基酸序列的一致性分别为73％、72％、74％、70％、68％、73％。此全长cDNA序列已登录GenBank，登录号为AY841892。2．将SjHGPRT和SjSDISP编码基因克隆入原核表达载体pQE30、pGEX-4T-1和真核重组质粒pcDNA3，通过双酶切、PCR和测序鉴定，表明重组质粒构建成功。原核重组表达质粒SjHGPRT／pQE30和SjHGPRT／pGEX-4T-1；SjSDISP／pQE30和SjSDISP／pGEX-4T-1，在大肠杆菌中均获高效表达。SDS-PAGE和Western blot分析显示，重组融合蛋白分子量大小与预期完全一致，并且均具有抗原性（免疫原性和免疫反应性）。间接免疫荧光定位表明，SjHGPRT和SjSDISP在成虫体壁实质细胞层中均有表达，但SjHGPRT表达水平较高。3．原核重组蛋白、真核重组质粒单独免疫以及真、原核联合免疫后，进行日本血吸虫尾蚴功击感染，结果表明：除真核组中SjSDISP／pcDNA3在减虫方面及二价重组蛋白免疫组在减虫和减卵方面与对照比效，无统计学意义外，其它各组在减虫和减卵方面与对照比效，均具有统计学意义，其中真、原核联合免疫组免疫保护性效果最好。结论：1)采用锚式PCR首次获得SjHGPRT和SjSDISP二基因全长cDNA，SjHGPRT全长cDNA 1270bp；SjSDISP全长cDNA 1071bp，且均在GenBank中成功注册登录。2)成功构建了SjHGPRT和SjSDISP目的基因单价、二价原核重组表达质粒和真核重组质粒；原核重组表达质粒在大肠杆菌中获得高效表达；纯化的原核重组表达融合蛋白具有天然蛋白相同的抗原性；目的基因在成虫体壁均有表达，但SjSDISP基因表达水平相对较低。3) SjHGPRT和SjSDISP免疫小鼠均获部分抗血吸虫病免疫保护性效果；原核重组蛋白和真核重组质粒联合免疫能提高免疫保护性效果；减卵率普遍高于减虫率，表明二基因可能主要在抗血吸虫卵胚发育或抗生殖方面起重要作用。