小菜蛾Bt抗性的AFLP标记研究

论文摘要

苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt）是目前世界上用途最广、产量最大的微生物杀虫剂,在世界范围内得到广泛的应用。但目前转Bt基因农作物和Bt制剂的使用正面临着害虫对Bt抗药性的威胁。小菜蛾Plutella xylostella（L.）是十字花科蔬菜的重要害虫,也是最早发现的对Bt产生抗药性的田间种群,其抗药性仍在增长。本研究采用分子生物学技术,分别以美国敏感、美国抗性（以CrylAc毒蛋白进行选育）、国内田间采集（室内分别以CrylAc毒蛋白汰选及Bt制剂汰选）小菜蛾种群为材料,建立了有效的AFLP分子标记体系,筛选出Bt抗性小菜蛾种群中的特异性基因片段;运用基因克隆技术,对小菜蛾抗Bt毒素特异性基因片段进行了克隆和序列分析。主要结论如下:1.比较了小菜蛾饲养笼与小菜蛾饲养箱对饲养小菜蛾的差异,结果表明,用小菜蛾饲养笼饲养的小菜蛾种群产卵量高,发育更整齐。2.用CrylAc毒蛋白及Bt制剂分别对小菜蛾进行了室内抗性选育,获得对CrylAc毒蛋白抗性倍数为14.8和24.43的两个小菜蛾抗性种群-美国抗性种群和深圳抗性种群,以及对Bt制剂抗性倍数为74.47的小菜蛾上海抗性种群。3.利用AFLP技术对小菜蛾抗性与敏感种群对Bt毒素抗药性在基因上的差异进行研究。64对AFLP引物组合共扩增出2024条清晰的条带,平均每对引物可获得32条扩增条带。其中,11对引物能够在对Bt毒素抗性与敏感的小菜蛾种群间扩增出特异表达条带,特异表达检出率为8.79%。11对引物共扩增出32条特异表达条带。4.AFLP分子标记与PCR技术相结合,从银染后的PAGE胶上将特异性目的片段挖带回收,与pEASY-T载体连接,从三个抗性小菜蛾种群中共克隆出14条可能与Bt抗性相关的特异性基因片段。5.对其中的一条特异性基因片段设计特异性引物,经PCR扩增检测验证,可在所有的抗性种群中扩增出一条106bp的条带,而敏感种群没有,证明该片段小菜蛾对Bt产生抗药性相关,可用于小菜蛾对Bt抗性的早期检测。其它特异性基因片段是否与小菜蛾对Bt毒素产生抗药性相关,这些都有待于进一步的试验验证。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 目录
• 第一章 文献综述
• 1 昆虫抗药性的概念
• 2 小菜蛾抗药性的历史和现状
• 2.1 小菜蛾抗药性发展现状
• 2.2 小菜蛾对 Bt的抗性现状
• 3 小菜蛾抗药性的危害
• 3.1 危害农作物的生产
• 3.2 加剧农药污染问题
• 3.3 破坏对害虫的自然控制作用
• 4 昆虫抗药性的研究及监测技术
• 4.1 生物测定技术
• 4.2 生化检测技术
• 4.3 分子标记技术
• 4.4 基因芯片技术
• 5 论文设计
• 5.1 立论依据
• 5.2 研究的内容与方法
• 5.3 主要创新点
• 5.4 技术路线
• 第二章 小菜蛾室内饲养技术及抗性选育
• 1 材料和方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 供试药剂
• 1.3 研究方法
• 2 结果和分析
• 2.1 成虫的饲养
• 2.2 幼虫期甘蓝苗饲养
• 2.3 小菜蛾对 Bt制剂的抗性选育
• 2.4 小菜峨对 Cry1Ac毒蛋白的抗性选育
• 3 小结与讨论
• 第三章 AFLP分子标记体系的建立及引物筛选
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 实验方法
• 2 结果与分析
• 2.1 DNA的浓度与纯度
• 2.2 酶切连接及预扩增
• 2.3 选择性扩增
• 2.4 引物的选择
• 2.5 Bt抗性小菜蛾品系和敏感品系间特异性片段的AFLP分析
• 第四章 Bt抗性小菜蛾种群的特异性片段的回收、克隆与序列分析
• 1 材料和方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验方法
• 2 结果与分析
• 2.1 特异性基因片段回收后 PCR扩增
• 2.2 PCR产物纯化回收后电泳图
• 2.3 特异性片段 PCR扩增产物的克隆及鉴定
• 2.4 核酸序列结果与分析
• 2.5 特异性基因片段的验证
• 3 小结与讨论
• 第五章 全文主要结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介