小麦光敏色素C的克隆与表达分析

论文摘要

植物光信号受体参与各个发育阶段的调控,包括光敏色素（phytochrome）和隐花色素（crytochrome）。光敏色素主要参与红光和远红光信号的转导,隐花色素主要介导蓝光和紫外光A波段的信号转导。在拟南芥中,光敏色素基因家族包括PHYA、PHYB、PHYC、PHYD和PHYE。其中,PHYC编码的光敏色素C除转导红光信号外还特异地控制叶片的发育。转基因研究表明,用拟南芥光敏色素基因转化作物,可获得植株矮化、避荫性反应降低和光合效率提高的效应,有可能通过单株产量和种植密度的增加显著提高作物产量。在水稻、小麦、玉米等几种主要的谷类作物上,有关光敏色素基因的研究较为滞后。现有结果表明,谷类作物光敏色素基因只存在PHYA、PHYB和PHYC三个家族,其生理功能还不明确。而且关于小麦PHYC基因的拷贝数和染色体定位存在分歧,一种看法认为只有4B染色体上的1个拷贝,另一看法认为在5A、5B和5D染色体上各存在1个拷贝,但对于小麦PHYC基因的这些拷贝表达的状况都没有进行分析。因此,本研究以小麦模式品种中国春为材料,根据认为有三个拷贝的观点提供的序列（GenBank序列号:AY672997、AY672999和AY6723000）,设计引物克隆中国春PHYC基因的全长序列,然后利用SNP设计三对特异引物筛选各个拷贝的TA克隆。同时同源克隆一粒小麦（AA染色体组）、二粒小麦（AABB染色体组）和粗山羊草（DD染色体组）的PHYC基因,通过序列比对分析小麦及其亲缘种之间PHYC基因序列的相似性,以确认小麦PHYC基因的来源。利用DNAMAN对小麦、大麦、水稻、高粱、玉米PHYC基因进行进化分析。利用NCBI的CDD工具分析中国春PHYC蛋白结构,并与拟南芥比较分析结构差异。利用全长引物扩增得到了中国春的PHYC基因cDNA全长产物,并在其TA克隆中利用特异引物筛选到三个拷贝的克隆。将这三个小麦PHYC基因分别定名为TaPHYC1、TaPHYC2和TaPHYC3,三个拷贝间的同源性达到99.11%。在小麦亲缘种中克隆得到的PHYC基因序列与这三个拷贝比较发现,TaPHYC1与一粒小麦PHYC基因及二粒小麦PHYC1基因相似度最高,TaPHYC2与二粒小麦PHYC2基因相似度最高,TaPHYC3与粗山羊草PHYC基因相似度最高。因此推测TaPHYC1来源于A染色体组,TaPHYC2来源于B染色体组,TaPHYC3来源于D染色体组。进化分析表明,小麦等一系列C3植物的PHYC基因归为一类,与C4植物相区别。小麦的PHYC蛋白结构同拟南芥比较,发现小麦少一个PAS（周期性反应及核定位）结构域多一个HisKA（组氨酸激酶A）结构域,因此中小麦的PHYC蛋白可能与拟南芥有不同的光信号转导模式。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 一、文献综述
• 1 拟南芥中研究进展
• 1.1 拟南芥光敏色素家族及生理功能
• 1.1.1 拟南芥光敏色素家族
• 1.1.2 种子萌发和幼苗的去黄化
• 1.1.3 营养生长发育和生物节律钟
• 1.2 拟南芥PHYC研究进展
• 1.2.1 拟南芥PHYC基因
• 1.2.2 PHYC的过表达与功能缺失突变体分析
• 1.2.3 PHYC与拟南芥开花期分离的关系
• 2 谷类作物中研究进展
• 2.1 谷类作物的光敏色素
• 2.1.1 光敏色素对谷类花期的控制
• 2.1.2 光敏色素与避荫性
• 2.2 谷类作物PHYC研究进展
• 3 光敏色素在作物改良中的应用
• 4 立题依据
• 二、材料与方法
• 1 材料及处理
• 1.1 植物材料
• 1.2 细菌、载体和引物
• 1.3 主要试剂
• 1.4 溶液及培养基
• 1.4.1 质粒提取液
• 1.4.2 电泳缓冲液
• 1.4.3 培养基
• 2 实验方法
• 2.1 引物设计
• 2.2 普通小麦PHYC基因的克隆
• 2.2.1 Trizol（invitrogen）法提取RNA
• 2.2.2 感受态细胞的制备（无菌操作）
• 2.2.3 E.coli的热激转化法（无菌操作）
• 2.2.4 逆转录及PHYC的扩增反应:
• 2.2.5 目的扩增片段的回收:
• 2.2.6 E.coli质粒小量提取
• 2.2.7 PHYC基因表达的确认
• 2.2.8 阳性克隆鉴定及测序
• 2.3 小麦PHYC基因的来源及进化分析
• 2.4 各拷贝的表达分析
• 三、结果与分析
• 1 普通小麦PHYC基因的克隆及分析
• 1.1 普通小麦PHYC基因cDNA序列的克隆
• 1.2 小麦PHYC基因的序列分析
• 2 普通小麦PHYC各个拷贝的来源
• 3 普通小麦PHYC各个拷贝的表达差异
• 四、讨论
• 1 小麦PHYC基因的进化
• 2 普通小麦PHYC基因的拷贝数
• 3 普通小麦PHYC的表达调控
• 4 光敏色素信号系统一种改良作物的新方法
• 参考文献
• 致谢
• 附录