hnRNP-R/hnRNP-Q在视网膜感光反应中的表达调控及功能研究

论文题目: hnRNP-R/hnRNP-Q在视网膜感光反应中的表达调控及功能研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 生理及生物物理

作者: 黄嘉

导师: 徐平

关键词: 神经发育,亚型,克隆,表达,抗体制备,亚细胞分布,细胞,诱导,代谢,缺失突变

文献来源: 复旦大学

发表年度: 2005

论文摘要: 本论文的主要研究方向是研究神经系统发育过程中相关基因的表达调节及相关功能。为此,我们首先采用cDNA微阵列技术对不同胎龄人的脑组织进行了差异表达分析并筛选到了数个差异表达的基因。经过进一步的Northern blot分析,我们筛选出了细胞色素C氧化酶亚单位Ⅲ(COX-Ⅲ)和核内不均一性核糖核蛋白R(hnRNP-R)这两个在神经发育过程中差异表达的基因。实验结果显示COX-Ⅲ的表达在神经发育过程中显著上调,而hnRNP-R的表达在神经发育过程中呈下调趋势。由于本实验室的研究主要定位于前体mRNA加工过程,而最近有报道指出编码RNA结合蛋白的hnRNP-R参与了神经组织中的前体mRNA加工过程,所以我们选择了hnRNP-R来进行进一步的研究。为了研究hnRNP-R的表达和功能,我们利用匙孔血蓝蛋白(KLH)交联的人工合成短肽制备了特异性的hnRNP-R抗血清。我们采用Western blot分析的方法检测了hnRNP-R在多种细胞中的表达。结果显示hnRNP-R在这些细胞中普遍表达。免疫细胞化学分析(ICC)结果说明hnRNP-R的胞内分布不随RA诱导P19细胞分化过程而改变。早前的一些报道指出一些基因的可变剪接模式能够调节它们的功能。所以我们利用计算机辅助分析预测了hnRNP-R的可变剪接模式。基于人类可变剪接数据库(HASDB)的数据分析,我们发现了hnRNP-R的转录产物具有七种可变剪接方式。读码框分析发现其中两种最可能编码蛋白质。我们通过RT-PCR分析和序列分析在胎儿脑组织中检测到了另外两种亚型的存在。其中一种就是已报道的hnRNP-R,我们称为hnRNP-R1。另一种与hnRNP-R1相比,缺少一个长度为114bp的外显子exon 5,其后续编码氨基酸并未发生移码。计算机预测分析显示这段外显子编码的氨基酸序列中存在一个色氨酸磷酸化位点和一个甲基化位点,这提示两个亚型由于exon 5的差别可能具有功能差异。由于蛋白质的胞内分布很可能影响其功能,我们检测了R28细胞和Hela细胞中绿色荧光蛋白GFP-hnRNP-R1和GFP-hnRNP-R2融合蛋白的胞内分布。Western blot分析的结果显示R28细胞中具有内源性表达的两个亚型,而HeLa细胞中只监测到hnRNP-R1。荧光检测结果显示GFP-hnRNP-R1和GFP-hnRNP-R2不论在神经细胞(R28)还是非神经细胞(Hela)中都具有类似的分布,两种亚型蛋白都均匀地分布在细胞核内。接着,我们利用RT-PCR和Western blot分析的手段检测了hnRNP-R两个亚型在人12周胎儿组织中的表达。RT-PCR结果都显示hnRNP-R1的表达明显高于hnRNP-R2,而且没有组织特异性。而相反的,hnRNP-R2则在神经组织中具有相对较高的表达。Western blot分析的结果与RT-PCR结果一致。结果说明hnRNP-R2的表达是具有神经组织特异性的,提示hnRNP-R2在神经发育中具有重要功能。为了说明hnRNP-R亚型在神经发育过程中的表达,我们检测了不同发育时期(12周和18周)胎儿神经组织中的hnRNP-R两种亚型蛋白质表达量。半定量分析结果显示hnRNP-R两亚型相对β-actin的比例随发育显著下调。而hnRNP-R2相对hnRNP-R1的比例也同时下调。这说明hnRNP-R自身的可变剪接在神经组织发育过程很可能具有重要的调节功能。为了进一步研究hnRNP-R在神经组织中的功能,我们对其在大鼠不同神经组织中的表达分布进行了分析。实验结果显示hnRNP-R在大鼠视网膜中表达量很高,这提示hnRNP-R在视网膜中具有重要的功能。通过对大鼠视网膜的免疫组织化学(Immunohistochemistry)分析发现,hnRNP-R蛋白仅分布在视网膜的神经节细胞层(GCL)和内核层(INL)的细胞中,在以光感受器细胞为主的外核层(ONL)中没有表达。这提示hnRNP-R在这两层细胞中可能具有特殊的功能。更有趣的是,hnRNP-R在视网膜中的定位与c-fos的昼夜调节模式吻合。有过往研究表明hnRNP-R的一个80%高度同源的蛋白质hnRNP-Q参与了c-fos mRNA的稳定性调节过程,并且能与hnRNP-R结合。这提示hnRNP-R,hnRNP-Q和c-fos三者之间可能存在一定的联系。c-fos在视网膜中的表达受到了昼夜周期的调控,而且其在GCL和INL的调控方式与其在ONL的调控方式完全不同。为此,我们建立了大鼠昼夜循环(LD12;12)模型并检测了hnRNP-R在昼夜变化过程中的表达调控。结果显示hnRNP-R在视网膜GCL和INL的表达随着昼夜调控变化并不一致。相对INL层中hnRNP-R的表达,GCL层中hnRNP-R的表达在从光照期到黑暗期切换的过程中发生下调。这提示hnRNP-R的表达在GCL中的表达调控机制与在INL中的不尽相同。为了研究hnRNP-R在视网膜中对c-fos表达的影响,我们需要选择合适的细胞模型来进行功能获得性(Gain-of-function)分析。我们选择了一个永生化的视网膜前体细胞R28细胞作为细胞模型。为了研究c-fos的表达,我们建立起bFGF诱导的c-fos表达模型。在该模型的基础上,我们进行了hnRNP-R的短暂转染实验。RT-PCR结果显示hnRNP-R抑制了R28细胞中bFGF诱导的c-fos的表达。这与前面昼夜调节结果的推测符合。c-fos的mRNA稳定性调节与其序列内部的几个顺式元件有关,其中研究的最多的就是位于c-fos mRNA 3’非翻译区(UTR)的AU富集元件(ARE)。早前报道显示hnRNP-Q能够增强插入有c-fos 3’-UTR ARE序列的RNA的稳定性。为了进一步研究hnRNP-R和c-fos之间的作用机制,我们构建了一个含有c-fos 3’-UTR的ARE序列的绿色荧光蛋白表达载体(GFP-ARE)。我们对hnRNP-R与GFP-ARE在R28细胞中的共转染样品进行了Western blot分析。结果显示hnRNP-R显著地抑制了GFP-ARE的表达。这说明hnRNP-R能够通过影响ARE-RNA的稳定性来调节c-fos的表达。此外,考虑到hnRNP-Q和hnRNP-R的高度同源性以及已报道的hnRNP-Q对c-fos的调节作用,我们同时也检测了hnRNP-Q在视网膜中的表达调控。我们首先采用与hnRNP-R抗血清制备方法一样的方法制备了hnRNP-Q的抗血清,并利用GST融合hnRNP-Q抗原肽段吸附纯化了hnRNP-Q抗血清。我们通过RT-PCR和Western blot分析从两个水平上分析了hnRNP-Q在大鼠视网膜的昼夜调控。结果显示hnRNP-Q的第8个外显子的剪接随着昼夜调节发生了明显的调控,而这种变化与c-fos的昼夜调控变化完全一致。这提示hnRNP-Q不同亚型对c-fos mRNA稳定性的影响不同。在hnRNP-Q已知的三个亚型中,hnRNP-Q2在第8个外显子的剪接模式上与hnRNP-Q1/hnRNP-Q3不同。然而Western blot分析在蛋白质水平上对hnRNP-Q1/Q2/Q3的检测并未显示明显的昼夜调控,这提示可能存在其他潜在调控机制。在对不同类型细胞的RT-PCR分析和Western blot分析的结果显示hnRNP-Q的剪接模式在不同细胞类型中是不同的,提示了hnRNP-Q可变剪接调节很可能影响细胞功能。此外,为了研究hnRNP-Q在视网膜细胞中通过ARE序列对c-fos mRNA的稳定性调控作用,我们对R28细胞进行了hnRNP-Q/GFP-ARE共转染分析,结果显示hnRNP-Q不同亚型对于ARE-RNA没有显著的影响。这提示hnRNP-Q不调节视网膜细胞中ARE-RNA的表达。结合本文所有有关hnRNP-R和hnRNP-Q的结果,我们的工作提示在视网膜细胞中c-fos mRNA的稳定性受到了hnRNP-R调控。而hnRNP-Q对视网膜细胞中c-los mRNA的稳定性没有影响。

论文目录:

中文摘要

英文摘要

前言

第一部分:神经发育相关基因的初步筛选

摘要

前言

材料和方法

结果

讨论

第二部分:hnRNP-R的表达分布与调节

摘要

前言

第一章兔抗人hnRNP-R抗血清的制备与初步应用

摘要

材料和方法

结果

第二章 hnRNP-R新亚型的克隆与表达分析

摘要

材料和方法

结果

讨论

第三部分:hnRNP-R在视网膜中的功能研究

摘要

前言

第一章 hnRNP-R在视网膜中的表达分布和昼夜调控

摘要

材料和方法

结果

第二章 hnRNP-R对c-fos稳定性的调节作用

摘要

材料和方法

结果

第三章 hnRNP-R影响ARE-RNA稳定性的突变分析

摘要

材料和方法

结果

讨论

第四部分:hnRNP-Q在视网膜中的功能研究

摘要

前言

第一章兔抗人hnRNP-Q抗血清的制备与纯化

摘要

材料和方法

结果

第二章 hnRNP-Q在视网膜中受昼夜调控

摘要

材料和方法

结果

第三章 hnRNP-Q已知亚型对ARE-RNA的调节作用

摘要

材料和方法

结果

讨论

论文小结

一、本论文的主要结果如下

二、本论文的计划后续工作

参考文献

综述一核内不均一核糖核蛋白在前体mRNA加工中的功能

综述二真核生物的mRNA代谢

致谢

攻读学位期间论文发表情况

发布时间: 2008-04-24

参考文献

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hnRNP-R/hnRNP-Q在视网膜感光反应中的表达调控及功能研究

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