论文摘要
辣椒疫病在世界范围内广泛发生的土传病害,严重影响世界各国的农业生产,造成巨大的经济损失,病原是辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici）。辣椒疫霉菌是一种土传卵菌,以卵孢子或厚垣孢子在土壤病残体中越冬,可以存活数月甚至更长时间,在适宜条件下引起青椒茎腐、根腐和枯萎;寄主范围广,除侵染辣椒外,还可以侵染西葫芦、黄瓜、番茄等20多种作物。目前,对于辣椒疫病的防治主要采用化学防治,而培育抗病品种效果不稳定,原因之一是辣椒疫霉具有较强的变异能力。因此,探索辣椒疫霉菌重要的致病因子,研究抗病性生理生化机制,结合抗病性遗传,抗病基因的QTL定位（quantitative trait loci）与基因工程,进行抗病性鉴定和抗病育种方面研究成为病害防治的前景。其中细胞壁降解酶在病害致病关键因子之一,包括角质酶（cutinase）,果胶酶（pectinase）,纤维素酶（cellulase）,半纤维素酶（hemicellulase）,蛋白酶（protease）等。而果胶酶又包括多聚半乳糖醛酸酶（PG）,果胶甲基酯酶（PME）,果胶裂解酶（PL）。果胶甲基酯酶（PME）是许多植物病原菌分泌的一种果胶酶,能降解植物细胞壁,许多病原真菌,卵菌,细菌在侵染过程都能分泌果胶甲基酯酶。本文以辣椒疫霉菌为研究对象,克隆辣椒疫霉果胶甲基酯酶基因及表达研究。以辣椒疫霉强致病和果胶甲基酯酶活性高的菌株为实验材料构建的DNA文库,借助Pool-PCR技术分离了4个果胶甲基酯酶基因。对基因结构分析发现4个pme基因具有很高的同源性,并具有不同数目的糖基化位点。所编码的蛋白具果胶甲基酯酶的保守序列和蛋白活性位点。本研究发现,辣椒疫霉pme基因与卵菌pme基因具高度保守序列,也证明了卵菌在自然界中的分类地位。并且对其中一个基因构建质粒进行体外诱导表达,制备了多克隆抗体,借助蛋白印记杂交验证了重组蛋白的免疫活性,其具体研究结果如下:1、Pool-PCR法筛选基因文库,分离了4个果胶甲基酯酶基因从GenBank中下载若干pme基因,同源比对设计多对引物（ P230+ AP650,P230+ P920,P230+ P795,P445+ P920,P445+AP650, P620 + P920 ,P650+P920,P445+ P795）,然后进行反复筛选,分离了3个全长和1个非全长基因。利用引物P230+AP650筛选出pcpme6,P650+P920筛选出pcpme7和pcpme8,其中P445+P920和P445+P795均能扩增出pcpme9。将所克隆的4个基因经过blast,显示全部为果胶甲基酯酶基因。经过DNAman软件处理分析了这4个基因的基本结构,最大开放阅读框长度差别不大,均在1100bp左右,编码345-348个氨基酸,预测氨基酸分子量为37-38kDa。利用http://www.expasy.org和http://www.cbs.dfu.dk/service/signalP对这四个基因的信号肽和N糖基化位点进行预测,信号肽长度16-20个氨基酸不等,N-端糖基化位点4-7个不等,4个基因的理论PI值为5-9。2、RACE技术扩增pcpme9的3’端将辣椒疫霉菌置于三角瓶进行振荡培养7天后,收集菌丝。然后液氮研磨,利用Trizol法提取总RNA,经反转录酶作用,合成cDNA,作为模板,以通用引物（USP）和基因特异引物（GSP）进行第一轮PCR;以第一轮产物做模板,用巢式特异引物（NGSP）和巢式通用引物（NUSP）进行第二轮PCR,目的片段回收,连接,转化大肠杆菌DH-5α后,送样测序。将测序片段拼接后,对其进行了初步分析,果胶甲基酯酶基因pcpme9序列全长为1041 bp,最大开放阅读框ORF为1038bp（1-1038）,ORF编码一个346个氨基酸的蛋白质,预测编码产物大小约为38kDa,并有7个N糖基化位点,信号肽含16个氨基酸。3、pcpme6真核表达和Western blot根据已经克隆的pcpme6基因序列,设计特异性引物,PCR扩增其成熟肽片断。重组至酵母分泌型表达载体pPIC9K,构建重组表达载体pPIC9K/pcpme6,转化至大肠杆菌JM109中,筛选得到阳性克隆。重组质粒经stuⅠ线性化后转化毕赤酵母GS115感受态细胞,经G418筛选和PCR扩增转化子基因组筛选,得到数株基因工程酵母菌。SDS-PAGE分析发现,重组蛋白进行了特异表达,分子量大小为50KDa左右。通过将酵母分泌的PME蛋白免疫家兔,制备特异性抗体。Western blot分析结果进一步表明,转基因酵母成功表达,重组抗原有良好的免疫活性,多克隆抗体具有较高特异性和灵敏度,重组蛋白与制备的抗体特异性结合。