应激对黄颡鱼非特异性免疫细胞的影响

论文摘要

本研究首次系统地开展了应激对黄颡鱼（Pelteobagrus fulvidraco）非特异性免疫细胞影响的研究。采用光镜和电镜技术，对黄颡鱼外周血细胞的组成与结构，以及黄颡鱼头肾的组织发生与组织细胞结构进行了观察；以血清皮质醇为主要指标，监测了运输应激对外周血白细胞百分比和功能的影响；采用Percoll连续密度梯度离心法分离出黄颡鱼头肾巨噬细胞，对其显微、超显微结构与吞噬功能进行了观察，并进一步研究了外源皮质醇、巨噬细胞活化因子（MAF）、脂多糖（LPS）对头肾巨噬细胞呼吸爆发功能的影响；采用人工注射液体石蜡诱导腹腔炎症的方法，观察了黄颡鱼腹腔渗出细胞的类型及炎症过程中各类细胞相对数量和功能的变化特征，并进一步研究了外源皮质醇对腹腔渗出细胞数量与功能的影响。此外，还观察和研究了外源皮质醇对黄颡鱼幼鱼生长与外周血细胞数量的影响。具体研究结果如下。1．在血涂片上可鉴别出红细胞、血栓细胞、淋巴细胞、嗜中粒细胞和单核细胞，电镜观察可确认这5种细胞类型。血涂片上还观察到幼红细胞及正在分裂的红细胞。血栓细胞是数量仅次于红细胞的血细胞，在白细胞分类计数中占78％。淋巴细胞是核质比最高的血细胞，在白细胞分类计数中占17.5％。一种与斑点叉尾鮰（Ictalurus punctatus）非特异性细胞毒性细胞（NCC）相似的淋巴细胞被观察到。嗜中粒细胞是所观察到的唯一一种有粒细胞，是最大的白细胞，在白细胞分类计数中占3.7％。在嗜中粒细胞中只观察到一种含有丝状内涵物的特殊颗粒，呈椭圆状或杆状。单核细胞在白细胞分类计数中不超过1％。2．运输后的黄颡鱼在最初4～7d内，明显的行为变化是停止摄食。所有的鱼从第8d开始恢复了摄食，从第15d开始适应了日常管理活动。血液皮质醇和血糖浓度在刚刚运抵实验循环系统（0d）及第1d，2d，3d的鱼体内显著升高，至第7d已显著下降，并在第21d，28d，35d稳定在低水平上。外周血红细胞数量没有显著变化。与第21d，28d，35d外周血白细胞的各参数值相比，淋巴细胞百分比在第3d，7d显著减少，嗜中粒细胞百分比在0d，1d，2d，3d显著升高，吞噬细胞吞噬百分比和吞噬指数在第7d，14d显著降低。以上结果显示（1）运输使黄颡鱼成鱼产生典型的应激反应；（2）运输应激导致黄颡鱼成鱼外周血淋巴细胞和嗜中粒细胞百分比的显著改变和外周血白细胞吞噬功能的抑制；（3）运输应激后的池养黄颡鱼成鱼在本文使用的实验循环系统中充分恢复和驯化所需的最少时间是3周。3．出膜后1d，头肾仅由肾小管组成；出膜后2d，头肾小管间出现未分化的细胞团；出膜后7d，头肾小管间出现淋巴细胞团；此后淋巴细胞及造血细胞的数量逐渐增多；出膜后26d至43d，肾小管逐渐萎缩直至完全消失，头肾完成由排泄器官向淋巴器官的转变。黄颡鱼头肾不具有被膜，含丰富的静脉血管、血窦以及处于不同发育时期的各类免疫细胞。肾上腺组织细胞分布于头肾门静脉以及头肾组织中静脉管周边。黄颡鱼幼鱼头肾所含酸性颗粒细胞较成鱼头肾丰富，黄颡鱼成鱼头肾则具有较多的黑色素巨噬细胞，且常常在血管附近聚集形成黑色素巨噬细胞中心。黄颡鱼头肾免疫细胞的主要超微特征如下：细胞核质比和线粒体数量在淋巴细胞中差异较大。一种粒细胞及其所含特殊颗粒与外周血嗜中粒细胞相同；另一种粒细胞及其所含特殊颗粒与其他研究报道的鱼类嗜酸性颗粒细胞（EGC）或肥大细胞相同。单核细胞和巨噬细胞都含有丰富的溶酶体及线粒体、粗面内质网等细胞器，后者则根据功能状态的不同含有大小数量不等的吞噬泡。黑色素巨噬细胞含有极不规则的颗粒，颗粒具指纹特征。4．每尾黄颡鱼可分离出1.2-1.6mL浓度为1×107cells／mL的高纯度头肾巨噬细胞；培养3h-18h后，贴壁纯化的头肾巨噬细胞达到95-98％；分离培养的头肾巨噬细胞具有巨噬细胞的形态结构特征，对福尔马林灭活金黄色葡萄球菌（F-SA）的吞噬率达95％以上。PMA刺激分离的头肾巨噬细胞产生显著的呼吸爆发活动。在较高浓度和较长作用时间情况下，外源皮质醇对黄颡鱼体内外头肾巨噬细胞的呼吸爆发均产生抑制作用。5．采用ConA（10μg／mL）与PMA（10ng／mL）联合刺激单尾黄颡鱼头肾白细胞所制备的含巨噬细胞活化因子（MAF）上清液经1：4稀释后与头肾巨噬细胞孵育24h，能显著提高细胞的呼吸爆发活动。浓度分别为12.5、25、50μg／mL的LPS与头肾巨噬细胞孵育24h，对细胞的呼吸爆发活动都有显著的促进作用，且浓度越高促进作用越显著。6．腹腔注射液体石蜡后黄颡鱼腹腔渗出细胞主要包括嗜中粒细胞、巨噬细胞和嗜酸性颗粒细胞（EGC）。注射后2d，腹腔渗出细胞以嗜中性粒细胞为主（占嗜中粒细胞和巨噬细胞总数的61±1.1％），注射后6d、10d则以巨噬细胞为主（在嗜中粒细胞、巨噬细胞和EGC分类计数中分别占77.8±2.8％和82.3±1.1％），注射后6d出现EGC，随后数量逐渐增加。炎症过程中吞噬细胞（包括腹腔渗出嗜中粒细胞和巨噬细胞）对福尔马林灭活金黄色葡萄球菌（F-SA）的吞噬率和硝基四氮唑蓝（NBT）反应阳性细胞率逐渐上升。皮质醇混饲投喂使注射液体石蜡后6d腹腔渗出巨噬细胞百分比和吞噬细胞的吞噬率显著下降，EGC百分比显著上升。7．外源皮质醇混饲投喂（100mg／kg饲料）5周使黄颡鱼幼鱼增重显著受阻，使外周血白细胞数量显著减少、淋巴细胞百分比显著降低，但嗜中性粒细胞和单核细胞百分比则呈上升趋势。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACTS
• 缩略语表
• 第1章 鱼类应激与免疫抑制的研究进展
• 1.1 前言
• 1.2 应激的概念
• 1.2.1 应激概念的基础—内环境稳定学说
• 1.2.2 经典的应激概念
• 1.2.3 现代应激的概念
• 1.3 鱼类的应激反应
• 1.4 应激反应对鱼类生长、繁殖和健康的影响
• 1.4.1 应激反应对生长的影响
• 1.4.2 应激反应对繁殖的影响
• 1.4.3 应激反应对健康的影响
• 1.5 应激的监测
• 1.6 水产养殖生产中常见的应激因子
• 1.7 应激危害的预防
• 1.7.1 减少应激危害的措施
• 1.7.2 预防应激危害的研究动向
• 1.8 鱼类免疫系统概述
• 1.9 应激对鱼类非特性免疫系统的影响
• 1.9.1 研究应激对鱼类免疫系统影响的方法
• 1.9.2 应激对非特异性免疫细胞的影响
• 1.9.3 应激对非特异性免疫因子的影响
• 1.9.4 免疫-神经内分泌网络
• 1.10 研究应激对黄颡鱼免疫细胞影响的目的与意义
• 1.10.1 黄颡鱼简介
• 1.10.2 研究的目的
• 1.10.3 研究的意义
• 第2章 黄颡鱼外周血细胞的组成及其显微与超显微结构
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 实验鱼
• 2.2.2 血样采集
• 2.2.3 光镜样品制备
• 2.2.4 电镜样品制备
• 2.3 结果
• 2.3.1 红细胞数量、白细胞分类百分比和各类血细胞的大小
• 2.3.2 黄颡鱼外周血的显微结构
• 2.3.3 黄颡鱼外周血的超显微结构
• 2.4 讨论
• 2.4.1 采血过程
• 2.4.2 红细胞数量、白细胞分类百分比和各类血细胞的大小
• 2.4.3 血细胞的形态
• 第3章 运输应激对黄颡鱼外周血细胞数量及吞噬功能的影响
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 实验鱼
• 3.2.2 血样采集
• 3.2.3 吞噬原的制备
• 3.2.4 指标测定
• 3.3 结果
• 3.3.1 运输后行为的变化
• 3.3.2 运输后血浆皮质醇与血糖的变化
• 3.3.3 运输后外周血红细胞数与白细胞百分比的变化
• 3.3.4 运输后外周血白细胞吞噬功能的变化
• 3.4 讨论
• 第4章 黄颡鱼头肾的组织发生及组织结构
• 4.1 前言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 实验鱼
• 4.2.2 采样
• 4.2.3 光镜样品制备
• 4.2.4 电镜样品制备
• 4.3 结果
• 4.3.1 黄颡鱼头肾的组织发生
• 4.3.2 黄颡鱼头肾的基本结构
• 4.4 讨论
• 4.4.1 黄颡鱼头肾的组织发育
• 4.4.2 黄颡鱼头肾的组织学结构
• 4.4.3 黄颡鱼头肾细胞的超微结构
• 第5章 外源皮质醇对黄颡鱼头肾巨噬细胞功能的影响
• 5.1 引言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 实验材料
• 5.2.2 头肾巨噬细胞的分离
• 5.2.3 头肾单细胞悬液与分离细胞的组成和形态结构的观察
• 5.2.4 头肾巨噬细胞超微结构及吞噬作用的观察
• 5.2.5 贴壁头肾巨噬细胞形态、数量与吞噬作用的观察
• 5.2.6 呼吸爆发测定
• 5.2.7 不同皮质醇浓度对体外培养头肾巨噬细胞呼吸爆发活动的影响
• 5.2.8 腹腔注射皮质醇对体内头肾巨噬细胞呼吸爆发活动的影响
• 5.2.9 统计分析
• 5.3 结果
• 5.3.1 头肾单细胞悬液与分离细胞的组成和形态结构
• 5.3.2 头肾巨噬细胞的超微结构
• 5.3.3 贴壁巨噬细胞的形态
• 5.3.4 头肾巨噬细胞的吞噬作用
• 5.3.5 头肾巨噬细胞的呼吸爆发活动
• 5.3.6 不同皮质醇浓度对体外头肾巨噬细胞呼吸爆发活动的影响
• 5.3.7 腹腔注射皮质醇对头肾巨噬细胞呼吸爆发活动的影响
• 5.4 讨论
• 第6章 脂多糖（LPS）与巨噬细胞激活因子（MAF）对黄颡鱼头肾巨噬细胞呼吸爆发功能的影响
• 6.1 引言
• 6.2 材料与方法
• 6.2.1 实验材料
• 6.2.2 含MAF上清液的制备
• 6.2.3 头肾巨噬细胞的分离
• 6.2.4 MAF对头肾巨噬细胞呼吸爆发影响的测定
• 6.2.S LPS对头肾巨噬细胞呼吸爆发影响的测定
• 6.2.6 统计分析
• 6.3 结果
• 6.3.1 MAF对头肾巨噬细胞呼吸爆发的影响
• 6.3.2 LPS对头肾巨噬细胞呼吸爆发的影响
• 6.4 讨论
• 6.4.1 制备鱼类MAF的条件
• 6.4.2 鱼类MAF与LPS对巨噬细胞功能的影响
• 6.4.3 鱼类MAF的成分
• 第7章 皮质醇混饲投喂对黄颡鱼体腔炎症细胞的影响
• 7.1 引言
• 7.2 材料与方法
• 7.2.1 实验材料
• 7.2.2 腹腔炎症诱导方法与渗出细胞的收集
• 7.2.3 皮质醇混食投喂对腹腔渗出细胞百分比及功能的影响
• 7.2.4 指标测定
• 7.3 结果
• 7.3.1 腹腔炎性渗出细胞类型与形态特征
• 7.3.2 腹腔渗出嗜中粒细胞、巨噬细胞、EGC相对百分比的变化
• 7.3.3 腹腔渗出嗜中粒细胞、巨噬细胞功能的变化
• 7.3.4 皮质醇混食投喂对腹腔渗出细胞百分比及功能的影响
• 7.4 讨论
• 7.4.1 腹腔渗出细胞类型与组成百分比
• 7.4.2 腹腔渗出细胞的形态特征与功能
• 7.4.3 应激对腹腔渗出细胞的影响
• 第8章 皮质醇混饲投喂对黄颡鱼幼鱼血细胞及生长的影响
• 8.1 引言
• 8.2 材料与方法
• 8.2.1试验材料
• 8.2.2 试验分组
• 8.2.3 采样
• 8.2.4 细胞形态和白细胞分类计数
• 8.2.5 红细胞和白细胞计数
• 8.2.6 血糖的测定
• 8.2.7 肝糖原的测定
• 8.2.8 组织学观察
• 8.2.9 统计分析
• 8.3 结果
• 8.3.1 皮质醇混饲投喂对黄颡鱼幼鱼体重、肝糖原、血糖的影响
• 8.3.2 皮质醇混饲投喂对黄颡鱼幼鱼外周血细胞数量的影响
• 8.4 讨论
• 8.4.1 皮质醇对黄颡鱼幼鱼生长的影响及影响生长的机制
• 8.4.2 皮质醇混饲投喂对外周血细胞数量和白细胞分类计数的影响
• 参考文献
• 致谢
• 附录